Catalin Doneanu、Paul Rainville和Robert S. Plumb

沃特世公司（美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德市）

 

在定量血清中的治療性蛋白時(shí)，不進(jìn)行分析物預(yù)分組分在降低檢測(cè)成本和簡(jiǎn)化樣品制備流程方面具有一定優(yōu)勢(shì)。分析物的分離（通常利用免疫親和性）需增加額外的純化步驟并使用昂貴的同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)計(jì)算分析物回收率。

 

另一種方法是采用具有較高色譜分辨率的LC系統(tǒng)，例如多維LC。設(shè)計(jì)用于測(cè)定復(fù)雜血清消化物（不進(jìn)行分析物分餾）中治療性蛋白質(zhì)的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）分析法在使用多維色譜時(shí)可獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。尤其是近年來(lái)，二維反相/反相(RP/RP)色譜在生物分析領(lǐng)域備受青睞。^1-52D-色譜法可以更好地分離分析物與樣品中的其他組分，從而降低分析物信號(hào)的抑制作用，這一優(yōu)勢(shì)極大地提高了業(yè)界對(duì)2D-色譜法的認(rèn)可度。使用相同量的樣品進(jìn)行分析時(shí)，2D-色譜技術(shù)相比1D LC方法具有更高的檢測(cè)靈敏度。

 

曲妥珠單抗（赫賽汀）是一種人源性IgG1 kappa單克隆抗體(mAb)。此抗體可通過(guò)基因工程^6,7獲得，也就是將人類(lèi)單克隆抗體的恒定區(qū)與能夠結(jié)合人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)蛋白質(zhì)受體的小鼠單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)進(jìn)行連接。這些HER2受體屬于人類(lèi)癌基因蛋白家族，在大約25%的浸潤(rùn)性乳腺癌中都有表達(dá)。在1998年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)曲妥珠單抗用于治療HER2-過(guò)度性乳腺癌。將曲妥珠單抗按照臨床劑量通過(guò)靜脈注射給藥，使HER2受體飽和。通常曲妥珠單抗的負(fù)荷劑量為4 mg/kg，之后每周劑量為2 mg/kg，從22位患者血漿中測(cè)得的曲妥珠單抗最高濃度平均值大約為70μg/mL。⁸

 

在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們將介紹采用高靈敏度的2D LC/MRM測(cè)定人體血清中曲妥珠單抗含量的過(guò)程，第一維反相色譜在pH 10.0下進(jìn)行梯度分離，第二維反相色譜在pH 2.5下進(jìn)行梯度分離。我們發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)生物分析中采用二維高pH/低pH RP/RP色譜能夠顯著降低離子抑制作用。