實(shí)驗(yàn)方案及色譜條件

點(diǎn)擊下載全部方案： 利用沃特世Prep 150 LC系統(tǒng)分離銀杏葉中的黃酮類化合物 

提取

將銀杏葉粉末(20 g)加入100 mL甲醇中，超聲60 min。加入40 mL 3N的鹽酸后，將此混合物加熱至沸騰并回流90 min。此回流操作可將黃酮苷水解成單個的黃酮化合物。冷卻至室溫后，使用Whatman #1濾紙對提取物進(jìn)行過濾即可，無需進(jìn)一步處理。

結(jié)果與討論

對制備所得的提取物進(jìn)行梯度UPLC^®分析，結(jié)果顯示其中槲皮素和山柰酚的濃度分別為0.088和0.104 mg/mL(未獲得異鼠李素的定量標(biāo)準(zhǔn)品)，根據(jù)UV (371 nm)條件下測得的峰面積百分比計(jì)算所得三種化合物的總體純度約為11%，14%和5%(圖3)。借助于先前開發(fā)出的分析級等度HPLC方法(圖4)，使用內(nèi)置于ChromScope軟件中的Analytical to Prep Gradient Calculator(分析級至制備級梯度計(jì)算器，圖5)可計(jì)算出幾何放大至內(nèi)徑為19 mm的色譜柱時(shí)所需的制備級分離流速。分析級至制備級梯度計(jì)算器是一款簡便且易用的工具，可進(jìn)行分析級至制備級操作的幾何縮放計(jì)算，提供流速與梯度時(shí)間計(jì)算信息。分析級方法到制備級方法的準(zhǔn)確放大可實(shí)現(xiàn)在分析級規(guī)模下進(jìn)行方法開發(fā)，從而能夠節(jié)省樣品并減少方法開發(fā)所需的溶劑使用量。放大的制備級色譜會與分析級色譜十分相似，使用戶能夠準(zhǔn)確地通過放大的制備級方法收集目標(biāo)峰。之前發(fā)布的應(yīng)用紀(jì)要3中對此類放大計(jì)算提供有更詳細(xì)的描述。

實(shí)驗(yàn)通過等度純化分離方法和基于閾值的餾分收集方法，使用0.25 mL的進(jìn)樣量實(shí)現(xiàn)了結(jié)果可接受的制備級分離(圖6)。通過ChromScope軟件可設(shè)置在收集時(shí)間段中通過閾值收集輕松實(shí)現(xiàn)各餾分的收集(圖7)。本示例中定義了一對收集時(shí)間段(3.0至4.0 min和6.0至7.5 min)，定義時(shí)間段以外洗脫出的所有峰都不會收集到最終的組分中。每個定義時(shí)間段中的洗脫峰必須滿足峰閾值條件(本示例中第一個時(shí)間段的閾值為25 mAU，第二個時(shí)間段閾值為15 mAU)
才能實(shí)現(xiàn)正確的收集操作。根據(jù)UPLC分析(數(shù)據(jù)未示出)，所收集餾分的純度分析顯示三種化合物的紫外吸收峰面積%純度分別為87%、96%和85%。

結(jié)論

■ 本實(shí)驗(yàn)采用沃特世Prep 150 LC制備級HPLC系統(tǒng)對銀杏葉粉末提取物中的物質(zhì)進(jìn)行了分離與純化。
■ 沃特世ChromScope軟件(1.4版)的全面化系統(tǒng)控制提供了出色的系統(tǒng)靈活性，用戶可對所有的方法參數(shù)進(jìn)行輕輕修改。
■ 實(shí)驗(yàn)先開發(fā)出了分析級分離方法，然后利用分析級至制備級梯度計(jì)算器將此方法幾何放大至Prep 150 LC系統(tǒng)上的19×100 mm制備級色譜柱。
■ 簡單易設(shè)置的餾分收集實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)化合物的精確收集。
■ 初始提取物中包含15%的槲皮素和18%的山柰酚，通過這套易于使用的Prep 150 LC系統(tǒng)可將每種組分的純度提高到87%以上。

參考文獻(xiàn)

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2. Natural Products Isolation 2nd edition, edited by S.D. Sarker, Z. Latif, A.I.,2006 Humana Press Inc, Totowa, NJ, U.S.A.
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