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細胞凋亡檢測操作流程三--JC-1檢測凋亡細胞線粒體膜電位改變

瀏覽次數(shù):4585 發(fā)布日期:2016-1-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負
凋亡檢測操作流程
  
三、JC-1檢測凋亡細胞線粒體膜電位改變

BD™ MitoScreen (JC-1)線粒體膜電位檢測試劑盒(551302):

組分 描述
JC-1(染料) 4瓶,每瓶用于25個樣本。凍干粉,使用前稀釋至儲存液(Stock Solution),使用時稀釋至工作液(Working Solution)
10 x Assay Buffer 60ml,足以用于100個樣本。使用前稀釋至1X

試劑準備:   

A.10× Assay Buffer的稀釋(Assay Buffer作為實驗的反應(yīng)液用于清洗細胞) :   

a) 使用前將10× Assay Buffer置于37°C水浴箱中至溶解。
b) 用雙蒸水1:10稀釋10× Assay Buffer,攪拌5分鐘。
c) 使用前將1× Assay Buffer 在37°C預(yù)熱。
 
JC-1儲存液的配制(一瓶): 
a) 室溫下每瓶用125μl DMSO 稀釋JC-1凍干粉。反復(fù)倒置混勻小瓶使JC-1充分溶解。
b) 儲存液應(yīng)立即稀釋為工作液或分裝成小份(避光操作),-20°C保存(可長達6個月)。
c) 避免反復(fù)凍融JC-1儲存液。

JC-1工作液的配制:
a) 37°C預(yù)熱1× Assay Buffer。
b) 用1× Assay Buffer 1:100稀釋 JC-1儲存液至JC-1工作液。例如將125μl的JC-1儲存液加入 12.375ml 預(yù)熱的1× Assay Buffer中。 實驗操作時,每個樣本(<106細胞)需要0.5ml的JC-1工 作液。
 c) 輕柔混勻JC-1工作液待用。(混勻后可能會出現(xiàn)少許JC-1聚集微粒,但并不影響流式檢測。也可在室溫13,000g離心3分鐘或 1,000g 離心15分鐘去除JC-1團絮。)

實驗操作:

1.制備1x106 /ml的細胞懸液, 濃度不宜過高,因為超過該濃度容易造成細胞的凋亡。

2.誘導(dǎo)細胞進行凋亡的處理,同時保留一份未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞作為對照。

3.凋亡處理結(jié)束后,每個無菌的15ml聚苯乙烯離心管中加入1ml細胞懸液,室溫下,400×g ,離心5分 鐘,棄上清。 

4.每管加入0.5 ml 新鮮配制的JC-1工作液,充分混勻后置于37°C的CO2培養(yǎng)箱,孵育10-15分鐘。

5.按以下步驟洗滌細胞兩次:
 
 第一次:每管加體積為2 ml的 1× Assay Buffer,輕輕懸浮細胞,振蕩或用槍頭使細胞分散,以免細 胞聚集成塊。400×g ,室溫離心5分鐘,棄上清。 
 
 第二次:每管加體積為1ml的 1× Assay Buffer,輕輕懸浮細胞,振蕩或用槍頭使細胞分散,以免細 胞聚集成塊。400×g ,室溫離心5分鐘,棄上清。 

6.每管加體積為0.5 ml的 1× Assay Buffer,輕輕懸浮細胞,上機檢測。

 

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