——熒光定量PCR篇——

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段, 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

（一）熒光閾值和CT值

熒光閾值（threshold）是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省（默認(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。 

CT值是指PCR擴(kuò)增過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 

CT值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，公式如下：Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex) 

n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。 

利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 

（二）熒光探針和熒光染料

熒光定量檢測(cè)根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料。 

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。SYBR Green I 用于qPCR無(wú)需探針，設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過熔點(diǎn)曲線分析可以鑒定有無(wú)PCR雜帶、引物二聚體等。但是SYBR Green I 無(wú)模板特異性，因此會(huì)引起假陽(yáng)性而影響定量的精確性。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)，特異性更高。

（三）qPCR注意事項(xiàng)

1. 用于qPCR反應(yīng)的RNA應(yīng)避免DNA的污染，RNA提取和反轉(zhuǎn)過程中應(yīng)小心謹(jǐn)慎。

2. 操作過程中避光，冰上操作。

3. cDNA模板避免反復(fù)凍融，否則會(huì)引起模板的降解。

4. 模板量不足或降解將導(dǎo)致CT值出現(xiàn)過晚或者不出現(xiàn)。對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的最高濃度做起。

5. 加入模板時(shí)應(yīng)先進(jìn)行適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，提高擴(kuò)增效率。但模板濃度過低導(dǎo)致重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。

6. 引物設(shè)計(jì)時(shí)，擴(kuò)增片段不宜太長(zhǎng)，一般在80-300bp均可；退火溫度要高，一般要在 60℃以上。并且要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。

7. 體系中引物濃度過高或者引物二聚體均會(huì)引起溶解曲線不止出現(xiàn)一個(gè)主峰。

8. 設(shè)置陰性對(duì)照，防止水和mix被污染。

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