玉米（Zea mays）原產(chǎn)于墨西哥和中美洲地區(qū)，是一種由古印第安人（Indians）在數(shù)千年前利用野生墨西哥類蜀黍（Euchlaenamexicana）（現(xiàn)存在于墨西哥和尼加拉瓜）雜交而來的品種。但是，作為一類重要的糧食作物，天然玉米籽粒在其營養(yǎng)價值上卻有著重要的缺陷。根據(jù)已有的文獻報道，玉米籽粒中，含量最大的儲藏性蛋白——醇溶蛋白中，賴氨酸和色氨酸這兩種人類必需的氨基酸含量嚴重缺乏，導致玉米籽粒整體營養(yǎng)價值不佳。因此，如何能夠提高玉米籽粒的營養(yǎng)價值就成為現(xiàn)代社會人類需要解決的一個重要課題。

有報道，玉米籽粒特異的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子Opaque2(O2)在籽粒發(fā)育過程中起到關鍵作用。Opaque2(o2)突變體相對于野生型籽粒而言表現(xiàn)出了顯著的粉質(zhì)胚乳的表型。有研究表明，O2基因可以結(jié)合22-kD α-zein醇溶蛋白啟動子的O2 motif（TCCACGTAGA）從而調(diào)控該基因家族的表達。除此之外，19-kD α-zein、14-kD β-zein、27-kD γ-zein和50-kD γ-zein同樣都是O2基因的調(diào)控對象，其最保守的結(jié)合結(jié)構(gòu)域為TGACGTGG。O2基因在玉米籽粒營養(yǎng)代謝中的價值巨大，與其有關的方方面面都被人們關注。但是，其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究卻始終沒有較全面的進展，以至于始終沒有深入的挖掘其生物學功能。

上海大學的研究人員通過對Opaque2的酵母雙雜交（Yeast two-hybrid screening）技術對其互作蛋白進行篩選以及功能分析，從而對Opaque2調(diào)控下游基因的表達的理論模型做出了進一步的解釋和完善。該研究成果已經(jīng)被國際著名學術期刊雜志PLOS Genetics接收，即將在線發(fā)表。該研究是上海大學通信學院的博士研究生喬禎逸在宋任濤教授和生命學院青年教師祁巍巍博士的指導下完成的。該研究中RNA-Seq服務由上海伯豪生物技術有限公司提供。

研究思路

研究結(jié)果

1.研究人員利用酵母雙雜交技術對O2蛋白的互作蛋白進行篩選，以期望能夠拓展O2在籽粒發(fā)育時期起到的作用機制。在酵母雙雜交實驗中，研究人員篩選到一個屬于MADS類轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白ZmMADS47，并且該蛋白與O2之間的互作通過GST Pull-down、coIP以及凝膠過濾實驗的驗證（圖1）。

2.ZmMADS47與O2的表達譜分析
研究人員對ZmMADS47的全長蛋白以及分段蛋白進行了轉(zhuǎn)錄激活能力的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ZmMADS47的C端不保守結(jié)構(gòu)域則表現(xiàn)出了極強的轉(zhuǎn)錄激活能力（圖2）。該結(jié)果中，ZmMADS47全長則僅僅表現(xiàn)出了較弱的轉(zhuǎn)錄激活能力。這可能是由于ZmMADS47的C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域被全長包裹其中使得其轉(zhuǎn)錄激活能力的不到釋放，而在酵母體系中又缺乏一些能夠使其轉(zhuǎn)錄激活能力得以釋放的因子，從而導致ZmMADS47全長在酵母中相對于玉米籽粒天然狀態(tài)中的構(gòu)型與修飾存在差異，從而影響了全長的轉(zhuǎn)錄激活能力。

3.ZmMADS47 RNAi株系的轉(zhuǎn)錄組表達譜分析

為了對ZmMADS47 RNAi后整體基因表達水平進行一個大致的了解，研究人員使用了上海伯豪的玉米mRNA高通量測序服務對ZmMADS47 RNAi籽粒的模式進行轉(zhuǎn)錄組層面的研究。GO歸類后發(fā)現(xiàn)，差異基因主要被歸類于營養(yǎng)儲藏類（表一）。
 

4.ZmMADS47 RNAi籽粒的表型觀察

qPCR、SDS-PAGE、Western-blot對醇溶蛋白RNA和蛋白水平的研究發(fā)現(xiàn)，α-zein和50-kD γ-zein的積累量都出現(xiàn)了一定程度的下降。但與o2突變體的opaque表型不同的是，ZmAMDS47 RNAi籽粒中并沒有出現(xiàn)明顯的opaque表型（圖3）。

5.蛋白體大小與形狀在ZmMADS47 RNAi籽粒中發(fā)生變化

研究人員對ZmMADS47 RNAi籽粒進行了透射電鏡的觀察，結(jié)果表明，突變體的蛋白體大小分配上出現(xiàn)變化，并且部分蛋白體出現(xiàn)畸形（圖4）。

6.ZmMADS47可以結(jié)合醇溶蛋白啟動子

研究人員對ZmMADS47和醇溶蛋白啟動子的體外結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47可以結(jié)合α-zein和50-kD γ-zein的CATGT啟動子，并且和O2一同調(diào)控醇溶蛋白的表達（圖5）。

7.ZmMADS47促進O2調(diào)控醇溶蛋白表達

ZmMADS47與O2瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞后發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47本身單獨不能激活下游靶標，而與O2一同轉(zhuǎn)化后，則可以不同程度的增加下游靶標的轉(zhuǎn)錄激活能力（圖6）。

8.O2釋放ZmMADS47的轉(zhuǎn)錄激活能力

研究人員通過對ZmMADS47，O2以及50-kD醇溶蛋白的突變研究表明，O2可以通過和ZmMADS47的蛋白互作釋放ZmMADS47 C端的轉(zhuǎn)錄激活能力，從而促進下游醇溶蛋白的表達（圖7）。

討論
本研究中，研究人員通過對Opaque2蛋白的酵母雙雜交篩庫篩選到了一個MIKC亞類的MADS類轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47。對ZmMADS47進行RNAi后的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47同樣對醇溶蛋白存在著調(diào)控關系。體外DNA－蛋白互作（EMSA）實驗證實ZmMADS47對α醇溶蛋白以及50-kD γ-zein有著直接結(jié)合。ZmMADS47與Opaque2的瞬時轉(zhuǎn)錄激活測試表明，Opaque2可以釋放ZmMADS47的轉(zhuǎn)錄激活能力，從而一同增強對α醇溶蛋白以及50-kD γ醇溶蛋白的調(diào)控。該研究成果不僅大大拓展了人們對玉米籽粒醇溶蛋白調(diào)控機制的認識，還對植物MIKC亞類MADS類轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育過程中的生物學功能有了進一步的延伸。

原文出處：Qiao ZY, Qi WW, Wang Q, et al. ZmMADS47 regulates zein gene transcription through interaction with Opaque2. PLOS Genetics.2016.