FluorCam葉綠素熒光成像技術應用案例（第四期）
FluorCam葉綠素熒光成像技術應用案例（第四期）
——FluorCam葉綠素熒光成像技術在國內的應用
FluorCam葉綠素熒光成像技術作為最早實用化的葉綠素熒光成像技術，是目前世界上最權威、使用范圍最廣、種類最全面、發表論文最多的葉綠素熒光成像技術。FluorCam已經發展出十幾個型號，涵蓋了從葉綠體、單個細胞、微藻到葉片、果實、花朵，乃至整株植物和植物灌層，幾乎可以測量所有的植物樣品，甚至包括含有葉綠素的微生物和動物。易科泰Ecolab生態實驗室總結了FluorCam相關SCI參考文獻近500篇，可聯系Ecolab生態實驗室（eco-lab@eco-tech.com.cn, info@eco-lab.cn）索取文獻目錄及全文。
了解FluorCam葉綠素熒光成像技術詳情請點擊以下鏈接：
FluorCam葉綠素熒光成像技術
FluorCam葉綠素熒光成像技術最早在21世紀初引進到國內，但一直到2010年后國內的科學家才在國際交流中逐漸發現這項技術的巨大價值，在短短數年中也利用這一技術發表了幾十篇高水平SCI文獻。本期主要介紹目前FluorCam葉綠素熒光成像技術在國內的應用情況。
一、 植物光合生理研究
葉綠素熒光可以直接反應植物光系統的生理狀況，因此從葉綠素熒光技術發明之初，就被用于各種植物光合生理研究。
山東農科院使用FluorCam葉綠素熒光成像技術研究了小麥旗葉與外露花梗光合能力的差異[1]。研究中發現在小麥生長前中期，旗葉與外露花梗的最大光化學效率Fv/Fm和量子產額ΦPSII基本相同。但在生長后期，旗葉的光合能力顯著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗葉（圖1）。這證明了在生長后期的灌漿期，花梗對維持籽粒的生長更為重要。
之后，他們又研究了小麥葉片和穎片季節衰老過程中以及穎果發育過程中光合特性的變化[2；3，圖2]。
二、 植物生/非生物逆境脅迫與抗性研究
由于幾乎所有種類的生物/非生物逆境脅迫都會影響到植物光合系統的正常生理功能，而葉綠素熒光技術是公認的植物逆境光合功能研究最靈敏的無損探針。因此通過FluorCam葉綠素熒光成像技術不但能反映植物受脅迫程度和抗逆能力的差異，而且能指明脅迫影響光合系統的具體機理過程。
1. 養分虧缺
山東農業大學使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化[4]。研究發現，施加氮肥使兩個品種的最大光化學效率Fv/Fm和量子產額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實際功能活性更有作用。同時玉米品種HZ4熒光參數的升高幅度也要高于Q319，這應該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米（圖3）。
山東農業大學使用FluorCam研究發現S-adenosyl-L-methionine (SAM)基因過表達會顯著增加在堿脅迫下的番茄的光合能力[5]（圖4）。
山東農科院研究了不同灌溉方式對小麥光合特性的影響[6]。研究發現比起傳統的漫灌，溝灌條件下的小麥葉片有更高的最大光化學效率Fv/Fm、量子產額ΦPSII、光化學淬滅qP和更低的非光化學淬滅NPQ（圖5）。這說明溝灌給小麥提供了更好的土壤水分條件，從而使小麥葉片擁有了更強的光化學活性。
三、 植物光合基因組學與分子生研究
植物光合作用可以說是植物對人類乃至整個生物圈最重要的功能，一方面為其他生物直接或間接地提供能量和食物，另一方面也在地球碳氧循環中發揮關鍵性作用。因此，對植物光合作用功能基因的研究，一直是植物基因組學與分子生物學研究的重中之重。而葉綠素熒光能直接反映相關功能基因的表型變化，所以幾乎所有與光合基因相關的研究都要用葉綠素熒光技術來進行表型篩選、基因功能驗證等方面的工作。
1. 從光合表型到基因功能表型到基因功能
中國科學院植物研究所張立新研究員是最早將FluorCam葉綠素熒光成像技術引入國內的科學家。中科院植物所光生物學重點實驗室是國內植物光合基因相關研究最前沿的科研單位。FluorCam葉綠素熒光成像技術引入后就立刻用于了光合相關基因功能與表型研究。
2006年，張立新研究團隊就使用FluorCam葉綠素熒光成像技術研究了擬南芥ppt1突變體光系統II光化學能力的變化，進而證明了磷酸鹽轉運蛋白對維持葉片生長后期正常光合作用的重要性[11]（圖6）。
之后，植物所張立新團隊和彭連偉團隊都使用FluorCam發表了多篇植物光合基因相關文獻[12；13]。
彭連偉在研究NADH脫氫酶復合體穩定性時[14]，發現在50μmol photons /m².s的光強下，lhca5 lhca6 pgr5、lhca6 pgr5和crr4-2 pgr5擬南芥突變體都產生了生長阻滯，并表現出了高葉綠素熒光（圖7A，B）。這表明了這些突變體的光合電子傳遞活性和NDH活性都受到了抑制。進一步分析不同光強下的ΦPSII，野生型、lhca5和lhca6突變體的ΦPSII水平是相近的，這表明Lhca5和Lhca6在光合電子傳遞中都不是必需的（圖7C）。而lhca6 pgr5和lhca5 lhca6 pgr5的ΦPSII水平則顯著降低，通過其他結果比對發現這是由于在低光照條件下，這些突變體的PSI就受到了光抑制并出現了氧化應激反應。
在后續的研究中，彭連偉團隊還使用FluorCam發現了NdhV亞基對NADH脫氫酶復合體穩定性的重要作用[15]。其團隊的張琳博士利用 FluorCam封閉式熒光成像系統，從 T-DNA插入或EMS誘變的擬南芥突變體庫中篩選光合電子傳遞調控的突變體，并重點研究了bfa3的功能，相關結果于 2016 年 4 月發表在國際學術期刊Plant Physiology[16]。憑借這一科研發現，張琳博士榮獲易科泰FluorCam葉綠素熒光成像優秀論文一等獎。
國內另一個應用FluorCam技術進行光合基因研究較為出色的單位是西北農林科技大學。他們引進儀器技術雖然較晚，但在購置FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統后很快就發表了2篇高水平文章，研究了多個關于擬南芥葉綠體發育和葉片顏色相關的基因功能[17；18]（圖8）。
上海生命科學研究院青年研究組長、博士生導師Chanhong Kim在蘇黎世聯邦理工學院、康奈爾大學博伊斯湯普森研究所工作期間就已經使用FluorCam葉綠素熒光成像系統進行了大量的研究工作并在PNAS、Plant Cell發表多篇相關文獻。2014年，Chanhong Kim到上海生命科學研究院工作后立刻購置了一臺FluorCam封閉式葉綠素熒光/GFP成像系統。他用這一系統一方面進行GFP表達植株的快速篩選（圖9），另一方面進行單線態氧和EXECUTER1介導信號在基粒中發生過程的研究，這一最新研究成果發表同樣在2016年PNAS上[19]。
沈陽農業大學也使用FluorCam技術開展了大白菜生長緩慢、類囊體減少的突變體光和特性的研究[20]。
2. 從基因功能到光合表型
在有的研究中，光合基因功能是通過其他方法基本上確定的。但這個基因表達出的表型是否符合預期，還是必須通過FluorCam葉綠素熒光成像技術進行光合表型方面的驗證。
中國農業大學與易科泰生態技術有限公司EcoLab生態實驗室合作，從黃瓜中克隆了紫黃質脫環氧化酶基因（CsVDE），再將這一基因的反義片段轉基因到擬南芥中[21]。發現在高光脅迫條件下，轉基因擬南芥的葉綠素熒光參數非光化學淬滅（NPQ）比野生型顯著降低，這證明了CsVDE在葉黃素循環和PSII光抑制敏感性上的重要作用（圖10）。
由于FluorCam葉綠素熒光成像技術引進到國內的時間較晚，國內科學家對這一技術的運用程度還低于歐美同行。因此，很多國內的科學家目前是與國際上的知名科研院所開展合作，使用FluorCam進行研究工作并發表文章。比如浙江大學與德國康斯坦茨大學合作發表的使用FKM多光譜熒光動態顯微成像系統（此系統應用了FluorCam顯微成像技術，康斯坦茨大學Kupper教授和PSI公司合作完善了這一技術，是國際上對這一技術應用最前沿的學者）研究了銅對海州香薷Elsholtzia splendens光合系統的毒害作用[22]；華中農業大學、江西農業大學與德國洪堡大學等單位合作研究了病毒介導的豌豆基因沉默對四吡咯生物合成、葉綠體發育等造成的影響[23]；內蒙古農業大學與捷克科學院等單位合作研究的芽單胞菌門含有葉綠體的稀有細菌的光合特性和相關基因研究[24；25]；江蘇農科院與英國諾丁漢大學合作研究的兩種病原菌對不同小麥品系的侵害性[26]等。
——FluorCam葉綠素熒光成像技術在國內的應用
FluorCam葉綠素熒光成像技術作為最早實用化的葉綠素熒光成像技術，是目前世界上最權威、使用范圍最廣、種類最全面、發表論文最多的葉綠素熒光成像技術。FluorCam已經發展出十幾個型號，涵蓋了從葉綠體、單個細胞、微藻到葉片、果實、花朵，乃至整株植物和植物灌層，幾乎可以測量所有的植物樣品，甚至包括含有葉綠素的微生物和動物。易科泰Ecolab生態實驗室總結了FluorCam相關SCI參考文獻近500篇，可聯系Ecolab生態實驗室（eco-lab@eco-tech.com.cn, info@eco-lab.cn）索取文獻目錄及全文。
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FluorCam葉綠素熒光成像技術
FluorCam葉綠素熒光成像技術最早在21世紀初引進到國內，但一直到2010年后國內的科學家才在國際交流中逐漸發現這項技術的巨大價值，在短短數年中也利用這一技術發表了幾十篇高水平SCI文獻。本期主要介紹目前FluorCam葉綠素熒光成像技術在國內的應用情況。
一、 植物光合生理研究葉綠素熒光可以直接反應植物光系統的生理狀況，因此從葉綠素熒光技術發明之初，就被用于各種植物光合生理研究。
山東農科院使用FluorCam葉綠素熒光成像技術研究了小麥旗葉與外露花梗光合能力的差異[1]。研究中發現在小麥生長前中期，旗葉與外露花梗的最大光化學效率Fv/Fm和量子產額ΦPSII基本相同。但在生長后期，旗葉的光合能力顯著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗葉（圖1）。這證明了在生長后期的灌漿期，花梗對維持籽粒的生長更為重要。
之后，他們又研究了小麥葉片和穎片季節衰老過程中以及穎果發育過程中光合特性的變化[2；3，圖2]。
二、 植物生/非生物逆境脅迫與抗性研究
由于幾乎所有種類的生物/非生物逆境脅迫都會影響到植物光合系統的正常生理功能，而葉綠素熒光技術是公認的植物逆境光合功能研究最靈敏的無損探針。因此通過FluorCam葉綠素熒光成像技術不但能反映植物受脅迫程度和抗逆能力的差異，而且能指明脅迫影響光合系統的具體機理過程。
1. 養分虧缺
山東農業大學使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化[4]。研究發現，施加氮肥使兩個品種的最大光化學效率Fv/Fm和量子產額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實際功能活性更有作用。同時玉米品種HZ4熒光參數的升高幅度也要高于Q319，這應該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米（圖3）。
山東農業大學使用FluorCam研究發現S-adenosyl-L-methionine (SAM)基因過表達會顯著增加在堿脅迫下的番茄的光合能力[5]（圖4）。
山東農科院研究了不同灌溉方式對小麥光合特性的影響[6]。研究發現比起傳統的漫灌，溝灌條件下的小麥葉片有更高的最大光化學效率Fv/Fm、量子產額ΦPSII、光化學淬滅qP和更低的非光化學淬滅NPQ（圖5）。這說明溝灌給小麥提供了更好的土壤水分條件，從而使小麥葉片擁有了更強的光化學活性。
三、 植物光合基因組學與分子生研究
植物光合作用可以說是植物對人類乃至整個生物圈最重要的功能，一方面為其他生物直接或間接地提供能量和食物，另一方面也在地球碳氧循環中發揮關鍵性作用。因此，對植物光合作用功能基因的研究，一直是植物基因組學與分子生物學研究的重中之重。而葉綠素熒光能直接反映相關功能基因的表型變化，所以幾乎所有與光合基因相關的研究都要用葉綠素熒光技術來進行表型篩選、基因功能驗證等方面的工作。
1. 從光合表型到基因功能表型到基因功能
中國科學院植物研究所張立新研究員是最早將FluorCam葉綠素熒光成像技術引入國內的科學家。中科院植物所光生物學重點實驗室是國內植物光合基因相關研究最前沿的科研單位。FluorCam葉綠素熒光成像技術引入后就立刻用于了光合相關基因功能與表型研究。
2006年，張立新研究團隊就使用FluorCam葉綠素熒光成像技術研究了擬南芥ppt1突變體光系統II光化學能力的變化，進而證明了磷酸鹽轉運蛋白對維持葉片生長后期正常光合作用的重要性[11]（圖6）。
之后，植物所張立新團隊和彭連偉團隊都使用FluorCam發表了多篇植物光合基因相關文獻[12；13]。
彭連偉在研究NADH脫氫酶復合體穩定性時[14]，發現在50μmol photons /m².s的光強下，lhca5 lhca6 pgr5、lhca6 pgr5和crr4-2 pgr5擬南芥突變體都產生了生長阻滯，并表現出了高葉綠素熒光（圖7A，B）。這表明了這些突變體的光合電子傳遞活性和NDH活性都受到了抑制。進一步分析不同光強下的ΦPSII，野生型、lhca5和lhca6突變體的ΦPSII水平是相近的，這表明Lhca5和Lhca6在光合電子傳遞中都不是必需的（圖7C）。而lhca6 pgr5和lhca5 lhca6 pgr5的ΦPSII水平則顯著降低，通過其他結果比對發現這是由于在低光照條件下，這些突變體的PSI就受到了光抑制并出現了氧化應激反應。
在后續的研究中，彭連偉團隊還使用FluorCam發現了NdhV亞基對NADH脫氫酶復合體穩定性的重要作用[15]。其團隊的張琳博士利用 FluorCam封閉式熒光成像系統，從 T-DNA插入或EMS誘變的擬南芥突變體庫中篩選光合電子傳遞調控的突變體，并重點研究了bfa3的功能，相關結果于 2016 年 4 月發表在國際學術期刊Plant Physiology[16]。憑借這一科研發現，張琳博士榮獲易科泰FluorCam葉綠素熒光成像優秀論文一等獎。
國內另一個應用FluorCam技術進行光合基因研究較為出色的單位是西北農林科技大學。他們引進儀器技術雖然較晚，但在購置FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統后很快就發表了2篇高水平文章，研究了多個關于擬南芥葉綠體發育和葉片顏色相關的基因功能[17；18]（圖8）。
上海生命科學研究院青年研究組長、博士生導師Chanhong Kim在蘇黎世聯邦理工學院、康奈爾大學博伊斯湯普森研究所工作期間就已經使用FluorCam葉綠素熒光成像系統進行了大量的研究工作并在PNAS、Plant Cell發表多篇相關文獻。2014年，Chanhong Kim到上海生命科學研究院工作后立刻購置了一臺FluorCam封閉式葉綠素熒光/GFP成像系統。他用這一系統一方面進行GFP表達植株的快速篩選（圖9），另一方面進行單線態氧和EXECUTER1介導信號在基粒中發生過程的研究，這一最新研究成果發表同樣在2016年PNAS上[19]。沈陽農業大學也使用FluorCam技術開展了大白菜生長緩慢、類囊體減少的突變體光和特性的研究[20]。
2. 從基因功能到光合表型
在有的研究中，光合基因功能是通過其他方法基本上確定的。但這個基因表達出的表型是否符合預期，還是必須通過FluorCam葉綠素熒光成像技術進行光合表型方面的驗證。
中國農業大學與易科泰生態技術有限公司EcoLab生態實驗室合作，從黃瓜中克隆了紫黃質脫環氧化酶基因（CsVDE），再將這一基因的反義片段轉基因到擬南芥中[21]。發現在高光脅迫條件下，轉基因擬南芥的葉綠素熒光參數非光化學淬滅（NPQ）比野生型顯著降低，這證明了CsVDE在葉黃素循環和PSII光抑制敏感性上的重要作用（圖10）。
由于FluorCam葉綠素熒光成像技術引進到國內的時間較晚，國內科學家對這一技術的運用程度還低于歐美同行。因此，很多國內的科學家目前是與國際上的知名科研院所開展合作，使用FluorCam進行研究工作并發表文章。比如浙江大學與德國康斯坦茨大學合作發表的使用FKM多光譜熒光動態顯微成像系統（此系統應用了FluorCam顯微成像技術，康斯坦茨大學Kupper教授和PSI公司合作完善了這一技術，是國際上對這一技術應用最前沿的學者）研究了銅對海州香薷Elsholtzia splendens光合系統的毒害作用[22]；華中農業大學、江西農業大學與德國洪堡大學等單位合作研究了病毒介導的豌豆基因沉默對四吡咯生物合成、葉綠體發育等造成的影響[23]；內蒙古農業大學與捷克科學院等單位合作研究的芽單胞菌門含有葉綠體的稀有細菌的光合特性和相關基因研究[24；25]；江蘇農科院與英國諾丁漢大學合作研究的兩種病原菌對不同小麥品系的侵害性[26]等。
標簽：
FluorCam;葉綠素熒光
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