簡介

蛋白質印跡在1979年首先被提出。自那以后，隨著技術，試劑和成像技術的改進大大拓寬了蛋白質印跡的使用，使其成為當今生命科學的基礎實驗之一。

然而，Western印跡的一般工作流程變化不大。 首先進行蛋白的抽提，然后通過電泳分離蛋白質，轉印并用一抗和二抗進行雜交，最后顯色。 通過這些步驟，蛋白質印跡需要對設備，培訓，試劑投入大量的花費和時間的花費。

標準的Western印跡流程需要兩天的時間才能從樣本獲得圖像。 因此，在分析大量樣品或進行優化時，很容易看出Western Blotting會有一定的瓶頸。

IN-cell western - 對標準方法的重新思考，將蛋白質印跡中的蛋白質的準確定量與ELISA的重復性，快速性和高通量相融合。 細胞長在無菌的培養孔中，在原位固定和透化。 隨后用特定的一抗進行孵育，然后用特異性熒光標記的二抗進行孵育。 使用近紅外（NIR）光譜中的染料通常用于減少組織培養塑料板相關的自發熒光和噪音。

圖1：典型的in-cell western成像

Azure Biosystems Sapphire™雙模式多光譜激光成像系統專門設計用于在兩個NIR通道（658 nm和785 nm）以及可見熒光波長（488 nm和520 nm）內進行成像，從而實現在孔內的多重成像。 這種多重檢測允許在單個孔中評估多個感興趣的蛋白質。

通過使用光電倍增管（PMT）和雪崩光電二極管（APD）檢測器進行檢測，Sapphire可實現信號選擇性，靈敏度和成像速度使其成為細胞內蛋白質印跡的理想選擇。

材料和方法

細胞培養

將HeLa細胞進行系列稀釋并以每孔0.2mL的體積接種到無菌96孔組織培養板中，并生長至約80％。所有孔都使用100％甲醇室溫滲透15分鐘。

In-cell western

固定和透化之后，將細胞在PBS中沖洗，在室溫下用含1％魚膠的PBS封閉1小時，然后在4℃下孵育α-tublin和beta-actin 過夜。在用AzureSpectra 550和AzureSpectra 800的二抗孵育60分鐘，將樣品用PBS洗滌三次。

將二抗與RedDot ^TM 1核染色一起孵育用來歸一化總細胞數目。 成像前如前所述洗滌樣品板。

成像

洗滌后，使用Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統進行成像。

結果和討論

在本說明中，我們展示了使用Azure Biosystems Sapphire™雙模式多光譜系統在定量細胞內蛋白的能力。 HeLa細胞使用α-tublin和beta-actin抗體，接著分別用AzureSpectra 550和AzureSpectra 800二抗進行孵育。 將所有孔用RedDot ^TM 1核染色劑染色歸一化總細胞數目標。 使用Azure Biosystems Sapphire™雙模式多光譜激光成像系統獲取圖像，如圖2中所示。所顯示的圖像顯示了可實現較高的靈敏度和特異性。

將連續稀釋的HeLa細胞接種到96孔板中，培養，固定并透化。 A）使用AzureSpectra 550（綠色）探測第1-3列的beta-Actin 。 B）使用AzureSpectra 800（藍色）探測第3-6列的Tubulin 。 C）整個板用RedDot1核染色作為標準化對照（紅色）染色。 D）同時掃描各個通道，然后使用Sapphire Capture軟件將其圖像進行整合。

在96孔板上進行細胞Western blotting可以準確測量細胞內蛋白的原位表達; 并提供高通量的方法來評估多重檢測，終點檢測，感興趣的蛋白質和重復性。 通過使用NIR抗體和Azure Sapphire™雙模式多光譜激光成像系統，在多重分析的潛力和通量上都大大提高。