lncRNA促進胃癌進展的新機制研究思路分析

瀏覽次數：3054　發布日期：2018-8-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

Nature子刊|聯合南京醫科大發表重要研究成果：揭示lncRNA促進胃癌進展的新機制

近日，南京醫科大學第一附屬醫院的束永前團隊將最新的研究成果，以題為“Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer”發表于著名學術期刊《Oncogene》（影響因子：6.854）。該研究發現了促進胃癌進展的重要lncRNA FOXD2-AS1，并且揭示FOXD2-AS1通過EZH2和LSD1與目標基因結合而誘導轉錄沉默的新機制。FOXD-AS1通過EZH2和LSD1介導EphB3下調促進胃癌發生。這些結果表明在胃癌發生過程中FOXD2-AS1可以通過與EZH2和LSD1發生直接相互作用抑制EphB3發揮腫瘤誘導因子的作用，因此該分子或可成為檢測癌癥發生的新標志物。

研究背景：

Long noncoding RNAs (lncRNAs)是一組無蛋白編碼潛能，大小超過200個核苷酸的非編碼RNA。許多研究表明，lncRNA在不同的分子通路中發揮關鍵的調節作用，特異性的lncRNA與腫瘤的發生有關，例如FENDRR、TINCR和GAPLINC，并且在胃癌細胞中lncRNA異常富集。數據顯示，多種腫瘤相關的lncRNA通過與甲基轉移酶EZH2和去甲基化酶LSD1相互作用調節癌癥進展。

胃癌（GC）是世界上排名第四的惡性腫瘤，在東亞地區發病率較高，大多數病例由于早期無特定的癥狀而被診斷為晚期。此外，由于對胃癌發生的分子和遺傳機制知之甚少，治療方案也很有限。認識到遺傳和表觀遺傳失調與腫瘤發生有關，識別新的診斷和預后生物標志物，對預測胃癌的發生具有很好的應用前景。

研究思路：

此次云序生物和南京醫科大的研究團隊對FOXD2-AS1在胃癌進展中發揮的功能以及調控的相關生物學機制進行了深入研究，其思路和方法值得我們借鑒。本研究中，首先比較了GEO數據庫中GC和正常胃組織的lncRNA表達譜，發現了一種新的lncRNA FOXD2-AS1在GC中顯著過表達。深入分析發現FOXD2-AS1在GC中的上調與腫瘤大小、癌癥發展階段以及不良預后存在正相關關系。RACE分析和Sanger測序表明，該轉錄本增加了兩個外顯子。GO和GSEA分析顯示其與細胞周期和DNA復制顯著相關，FOXD2-AS1的敲除和過表達進一步驗證了生信分析結果。RIP和RNA pull down結果表明FOXD2-AS1與EZH2和LSD1蛋白結合。WB結合IHC證實了FOXD2-AS1與EphB3的相關性，并且利用ChIP、qChIP和ChIRP技術結合流式細胞術以及生信分析的手段，證明FOXD2-AS1通過將EZH2和LSD1引入到EphB3的啟動子中，抑制其轉錄。至此，成功揭示了FOXD2-AS1通過EZH2和LSD1介導的EphB3下調促進胃癌發生的新機制。

圖1.技術路線圖

研究內容：

1. LncRNA在GC中的表達譜

研究者利用現有芯片數據分析26對癌癥和非癌組織發現lncRNAs中41個表達上調，71個表達下調，其中H19，UCA1，PVT1和FOXD2-AS1在胃癌中上調顯著。為了評價lncRNA在GC中的作用，我們選擇了FOXD2-AS1，顯著P-Values和False discovery rate (FDR)分析表明FOXD2-AS1在GC組織中上調最為顯著。RACE分析和Sanger測序揭示其全聚（A）陽性序列和基因大小（3057bp）。UCSC和CPC分析證實FOXD2-AS1沒有蛋白編碼能力。檢測106例受試者中FOXD2-AS1的表達水平，對比癌組織/癌旁組織（T/N）比值，結果顯示FOXD2-AS1在GC組織中的表達量約70%。RT-qPCR驗證發現多種胃癌組織中FOXD2-AS1富集顯著增加。并且FOXD2-AS1的表達水平與腫瘤大小、浸潤性及腫瘤階段呈正相關。

圖2. GC中lncRNA表達譜分析

2. GC細胞中FOXD2-AS1富集高的患者預后較差

在芯片數據GSE51575基礎上，以正常組織作為對照，來評估FOXD2-AS1的診斷效果。ROC曲線下面積為0.919（95%置信區間[CI] 0.809-0.976; P < 0.0001）;特異性和敏感性分別為0.885和0.885。此外，發現區分腫瘤組織的臨界值為10.925（△Ct）和AUC為0.709（95% CI 0.643 -0.769; P < 0.0001），特異性和敏感性分別為0.726和0.632。利用Kaplan-Meier (K-M)曲線和log-rank方法分析FOXD2-AS1富集與無病生存(DFS)之間的相關性，發現高富集FOXD2-AS1的患者比低富集FOXD2-AS1的患者預后差。

圖3. FOXD2-AS1與GC患者預后關系

3. FOXD2-AS1是體外和體內的腫瘤誘導因子

為了評估FOXD2-AS1是否能促進GC進展，基于芯片數據GSE51575進行GSEA分析，結果顯示，細胞周期和DNA復制兩個增殖指標與高FOXD2-AS1表達組和低FOXD2-AS1表達組的基因特征最為相關。GO分析揭示了在FOXD2- AS1敲除的細胞中與細胞周期和DNA復制相關的基因的變化。此外，采用qPCR和WB檢測發現FOXD2-AS1富集變化顯著改變了腫瘤發生的關鍵基因的特征，提示FOXD2-AS1可能是胃腫瘤發生的關鍵調控因子。采用基因沉默和過表達的方法，揭示在裸鼠中FOXD2-AS1功能缺失能夠抑制胃癌細胞的細胞周期進程，而FOXD2-AS1的表達上調能夠促進癌癥進展。

圖4. FOXD2-AS1對GC進展的影響

4. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達

既往研究表明，lncRNA通過RNA結合蛋白調控下游因子，是否FOXD2-AS1介導的調控同樣通過類似的機制發生，研究者利用生物信息學方法結合RIP測序、RNA pull down技術最終驗證了FOXD2-AS1通過與甲基轉移酶EZH2和去甲基化酶LSD1的結合在GC細胞中發揮重要的調控作用。從RNA測序數據來看，FOXD2-AS1減少時，EphB3表達增加。敲除FOXD2-AS2后，發現EphB3表達顯著增加，而異位FOXD2-AS1表達降低了EphB3 mRNA的富集。WB證實了FOXD2-AS1的敲除和過表達在GC細胞中分表上調和下調了EphB3的水平。為了確定FOXD2- AS1是否通過將EZH2和LSD1招募到GC中的EphB3啟動子區來抑制轉錄，這里進行了功能的敲除和回補實驗以及ChIP檢測，發現EZH2和LSD1沉默后，EphB3上調。FOXD2-AS1的敲除降低了GC細胞的結合能力和誘導的修飾，而對照細胞則通過重組shRNA進行轉染。為了觀察FOXD2-AS1是否直接作用于靶色素，我們利用ChIRP方法分離染色質，分析了FOXD2-AS1依賴的EZH2/LSD1靶基因EphB3的位點，并使用qPCR檢測。ChIRP結果顯示FOXD2-AS1被招募到GC細胞的EphB3啟動子中。最后，在GC組織中評估EphB3表達，與FOXD2-AS1呈反比關系，同時，FOXD2-AS1過表達導致的EphB3沉默被同時EZH2或LSD1敲除逆轉。這些結果表明FOXD2-AS1可以將EZH2和LSD1引入到EphB3啟動子中，抑制其轉錄。

圖5. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達

5.促EphB3表達可抑制GC細胞增殖

數據顯示，相對于正常組織，GC組織中對EphB3的富集顯著降低，低的EphB3表達表明疾病進展。此外，將FOXD2-AS1與EphB3表達結合，可獲得較好的預后價值。使用IHC對106個匹配的GC及周圍正常組織的EphB3蛋白水平進行了評估，發現在約80%的非瘤性胃組織中，EphB3信號呈陽性，且這些腫瘤組織與周圍正常組織相比，大多表現出較低的EphB3蛋白表達。此外，EphB3蛋白表達水平越低，疾病階段越晚期。上述結果表明，低EphB3表達與GC進展有關。EphB3轉染實驗顯示EphB3與FOXD2-AS1誘導的GC細胞增殖有關。拯救實驗驗證了FOXD2-AS1通過阻斷EphB3表達來調控GC細胞生長。

圖6.促EphB3表達可抑制GC細胞增殖

總結：

云序生物&南京醫科大共同發表的這篇研究成果，為胃癌發生的機制提供了全新的認識。文章揭示FOXD2-AS1可能是胃癌關鍵的腫瘤促進基因，并有可能成為胃癌潛在的生物標志物和治療靶點。回顧全文，從實驗設計、開展，再到數據的分析，每一個思路每一個方法都值得我們學習和借鑒，正確的選擇是成功的一半，這些都離不開云序生物強大的科研團隊所做出的貢獻。

全文信息：

Tong-peng Xu, et al. Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer. Oncogene (2018), http://sci-hub.tw/10.1038/s41388-018-0308-y

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