KinExA分子與完整細胞相互作用系統的原理與應用

瀏覽次數：7731　發布日期：2018-11-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

KinExA®分子與細胞相互作用系統介紹

一、KinExA的技術背景：

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國創立，產品基于獨特的Kinetic Exclusion Assay（KinExA）專利技術。在公司成立早期，Xavier大學、美國陸軍和環境保護局等研究單位采用KinExA技術開展了大量工作；經過數十年在生物制藥領域、科研領域及環境監測領域的廣泛應用，KinExA技術已成為頂級制藥公司和生物技術公司以及許多大學、獨立研究實驗室和環境監測機構研究相互作用和生物活性物質檢測的必備工具，并且已得到FDA和EMA認可。

二、KinExA的技術原理：

在反應溶液中當受體和配體達到平衡狀態時，這時溶液中存在三種物質：受體、配體以及受體-配體復合物。KinExA技術通過包被受體或配體的珠子在極短時間內（<0.5s，不影響反應平衡）捕獲游離的配體或受體，再通過熒光標記的抗體檢測游離的配體或受體的量。檢測過程如下：

三、KinExA與SPR的區別

1、與SPR的區別：SPR在芯片表面固定一個分子，通過芯片表明與溶液間二維相互作用的物質量改變而實現SPR檢測。這就帶來了非常顯著的缺點：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質量遷移影響動力學分析（例如，流速會影響實驗結果）、被檢測分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結構其分子量有上限限制、樣品需要純化及無法檢測完整細胞。相反，KinExA分析三維水平及游離狀態相互作用，不固定任何分子、不會對平衡帶來影響、沒有質量遷移的限制、可以檢測未純化樣品和完整細胞；因此，極寬范圍內的生物分子、生物結構及完整細胞均可靈活分析。

2、與SPR技術對比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類型芯片，從Biacore系統獲得同一組單抗-抗原的53組數據，與KinExA實驗數據對比發現，親和力及動力學數據與所使用的芯片類型有關，帶負電荷的CM5，CM4及CM1芯片對Biacore的動力學數據有不利的影響。為了驗證這一假設，作者通過Biacore液相實驗，KinExA平衡態滴定以及KinExA動力學實驗，精確計算抗體與抗原的親和力及動力學參數。結果表明隨著芯片表面負電荷的降低，親和力及動力學參數與液相實驗所得的結果越接近。可能的原因：（1）帶負電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結合；（2）帶負電荷的抗原與芯片表面的負電荷靜電排斥。

表中的結果說明：對于Biacore技術，不同的固定方式（氨基偶聯，捕獲）以及不同的芯片，對實驗結果均有明顯影響。而采用KinExA技術，溶液中加葡聚糖，對結果也無明顯影響。

Drake A.W., et al. 2012. Biacore surface matrix effects on the binding kinetics and affinity of an antigen/antibody complex. Anal Biochem. 429(1):58-69.

四、KinExA的應用：

應用一、KinExA在CAR-T細胞治療中的應用

因多種因素的限制，自體CAR-T細胞治療產品可能在應用于患者前未必能夠進行全部項目的檢定，所以工藝驗證非常重要。工藝研究及驗證必須結合工藝的實際情況設定相應的驗證參數，CAR-T細胞產品工藝研究在不斷發展，到目前為止，業界對何種工藝最好并未達成共識。因此，可以在產品研發過程及早期臨床試驗階段開展不同程度的工藝驗證研究，工藝驗證完成后，應在關鍵工藝步驟設置關鍵過程控制參數及標準，以提高CAR-T細胞產品的生產一致性。

CAR-T細胞治療產品的質量控制研究及檢測項目一般應包括：細胞數量及其存活率、細胞表型、CAR陽性率檢測、生物學效力檢測，無菌檢測、支原體、熱原/內毒素的檢測、CAR-T細胞中病毒載體拷貝數及整合的檢測等。如果能夠檢測CAR-T細胞與抗原分子的親和力，以及CAR-T細胞上抗體的表達量，無疑會提升CAR-T細胞的質量控制標準。

目前市面上除了KinExA技術外，沒有其他特別有效的方式檢測完整細胞與分子間的親和力，更無從判斷細胞上分子的表達量。KinExA技術可以檢測細胞與分子間的親和力，并且可以計算細胞上分子的表達量。其檢測原理如下圖，先將梯度稀釋的細胞與恒定濃度的分子共同孵育達到平衡，離心之后收集上清液（此時上清液中只存在游離的分子），再通過已提前包被過的珠子捕獲游離的分子，用熒光標簽的抗體檢測游離分子的量，通過檢測器檢測得到相應的數值后，利用KinExA系統軟件進行數據分析。

下圖是國內某知名CAR-T公司通過KinExA技術檢測CAR-T細胞與抗原分子間相互作用的結果。

結果表明，CAR-T細胞與抗原的親和力Kd為45.41pM，T細胞表面CAR的表達水平為1.368e+5，Kd與EL的95%置信區間均較窄，數據非常準確可信。

應用二、KinExA在高親和力檢測上應用

對于抗腫瘤藥市場，目前精準醫療最為成熟的領域還是以靶向藥物為代表的抗腫瘤藥物。由于單克隆抗體類抗癌藥的副作用較小，且靶向性更好，因此，單抗藥物仍將是引領抗腫瘤藥物發展最為重要的領域。以PD-1為靶點的一類單抗藥呈現出較高的親和力，常規的相互作用檢測系統例如SPR 、BLI、ITC等由于自身原理的限制均不能檢測高親和力（pM級別）。KinExA技術有別于常規的相互作用檢測系統，能準確有效的檢測高親和力（fM級別）。

下表是Pfizer, Rinat兩家公司聯合發表的KinExA高親和力檢測范圍的文章。

Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

五、案例分析

案例一：完整細胞的相互作用檢測

背景：單克隆抗體XMetA是胰島素受體（IR）變構部分的激動劑，其激活代謝Akt激酶信號通路，而對有絲分裂胞外信號調節激酶（ERK）信號通路幾乎沒有影響。為了研究這種選擇性信號通路的性質，作者驗證了XMetA對CHO細胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

目的：完整細胞親和力檢測。

方法：研究者將表達短鏈型（IR-A）及長鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細胞分別與XMetA孵育，通過離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測胰島素與CHO細胞表面IR-A，IR-B的親和力。

結論：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數據同時說明， XMetA與IR亞型的結合與胰島素無關。

Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling

selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

案例二：細胞與上清未純化樣品檢測

背景：單克隆抗體（mAb）在體內與膜蛋白間親和力的可靠評估是腫瘤治療的主要問題。在BV展示系統中，膜蛋白能以天然狀態在病毒表面展示。

目的：細胞與上清中未純化樣品親和力檢測。

方法：研究者基于KinExA技術，結合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統，描述了一個簡單而高度敏感的單克隆抗體評估方法。

結論：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細胞分析方法一致（R2=0.998），表明基于KinExA技術檢測方法提供了針對細胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準確的評估。

Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem.

案例三：高親和力檢測

背景：白細胞介素-1β（IL-1β）是炎癥反應的有效介質，在許多淋巴細胞的分化中發揮調控作用。在一些炎癥和自身免疫性疾病中，血清中IL-1β水平與疾病的發展和嚴重程度相關。 IL-1β在一些疾病中的機理已經被臨床試驗證實，并獲得FDA的審批。

目的：高親和力檢測與驗證。

方法：設計抗IL-1β抗體XOM052，SPR檢測其與IL-1β的親和力為≤4pM。另外實驗采用Protein A捕獲IL-1β抗體，解離10min，發現時間不足以使抗體抗原發生解離，將解離時間延長至4h，解離早期無法準確擬合，推測是由于IL-1β抗體從Protein A上解離對實驗造成的影響。為了更精確的計算親和力，作者改用KinExA，分析得到其親和力為300fM。

結論：KinExA技術對于高親和力的檢測具有無可替代的優勢。