在熒光定量PCR檢測實(shí)驗中可以采用多種方法來進(jìn)行基因的定量。定量的方法也取決于實(shí)驗的目標(biāo)。當(dāng)實(shí)驗者對待測樣品中的核酸的具體拷貝數(shù)比較感興趣時，可以選擇絕對定量。如果實(shí)驗者關(guān)注的是實(shí)驗樣本與對照樣本之間的倍數(shù)變化，無需精確測定拷貝數(shù)，則選擇相對定量。目前相對定量方法適用于大多數(shù)基因表達(dá)研究，可分析對照樣本和一個或多個實(shí)驗樣本中目的基因表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)。

在此我們將詳細(xì)介紹目前使用廣泛且適用于基因表達(dá)研究的相對定量方法：2^-ΔΔCq法。首先相對定量也需要仔細(xì)規(guī)劃，實(shí)驗生成的數(shù)據(jù)是相對豐度，而非確切的基因拷貝數(shù)。

相對定量方法--2^-ΔΔCq

2^-ΔΔCq法是一種非常普遍的技術(shù)，它比較了包括對照樣本 (如未處理或野生型樣本) 和內(nèi)參基因 (如看家基因表達(dá)) 在內(nèi)的實(shí)驗樣本的結(jié)果。采用該方法，可根據(jù)檢測樣本和對照樣本中內(nèi)參基因的Cq來調(diào)整相同樣本中的目的基因的Cq。最后得出的ΔΔCq值可用于測定目的基因表達(dá)量的倍數(shù)差異。具體計算方法如下：

該方法要求內(nèi)參基因和目的基因具有相一致的擴(kuò)增效率，并盡可能接近100% 。確定擴(kuò)增效率的方法是采用同樣的樣本進(jìn)行梯度稀釋，生成內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（下圖）。確定內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率是否在90-110%的范圍內(nèi)，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)。

內(nèi)參基因的必要性

內(nèi)參即是內(nèi)部參照，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測基因的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實(shí)驗誤差，保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結(jié)果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發(fā)生表達(dá)改變的基因作內(nèi)參。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件：

① 不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的擴(kuò)增；

② 高度或中度表達(dá)，排除低表達(dá)；

③ 穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞)，而且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；

④ 表達(dá)水平與細(xì)胞周期及是否活化無關(guān)；

⑤ 其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；

⑥ 不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗處理措施的影響。

內(nèi)參基因的評估，可通過geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具來評估，這是保證結(jié)果可靠準(zhǔn)確的前提。其次可對候選的內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR 實(shí)驗做進(jìn)一步的篩選。首選在不同樣本中均穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，即比較各樣品中Cq平均值以及Cq值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，選擇SD最小的基因作為實(shí)驗內(nèi)參。

Azure Cielo^TM實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)——相對定量示例

1、實(shí)驗方法

方法:從組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR Green法進(jìn)行熒光定量檢測。

試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

實(shí)驗步驟:提取RNA→cDNA合成→設(shè)計特異性引物→qPCR擴(kuò)增→結(jié)果分析。

2、結(jié)果計算

Step1:ΔCq值=目的基因Cq–內(nèi)參基因Cq

Step2:ΔΔCq值=處理樣品ΔCq–對照樣品ΔCq

Step3:最后計算出倍數(shù)關(guān)系: 2-ΔΔCq值

3、相對表達(dá)量結(jié)果：

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