西班牙國家基因組分析中心、巴塞羅那科學與技術學院的研究團隊在《Nature Biotechnology》發表題為Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects的文章，從檢測靈敏度、細胞檢出類型、時間和花費成本等方面，對13種單細胞RNA測序技術進行了系統性比較。為研究人員根據自己的實際應用的需求，選擇使用不同的單細胞RNA-seq方法提供了指導。

實驗設計
研究人員將來自3個物種，5種類型（圖1左上）的細胞進行混合后，平均分成13份，分別進行不同方法的單細胞測序。這些樣本具有如下特征：

· 包含多種細胞類型；

· 某些細胞非常相似，基因表達只有細微的差異；

· 細胞具有可追蹤的標志物；

· 包含不同物種的細胞。

實驗結果
可以看出低通量plate-based的Quarts-seq2, CEL-seq2, Smart-seq2方法在靈敏度上還是遠強于其他高通量的方法，其中Quarts-seq2對三種細胞類型的基因檢出都是最高的， CEL-seq2的表現僅次于Quarts-seq2，但是優于其它方法。
 
Boxplots displaying the minimum, the first, second and third quantiles, and the maximum number of genes detected across the protocols, in down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells. Cell identities were defined by combining the clustering of each dataset and cell projection on to the reference.

對于標記基因的檢測，不同的方法檢測結果大不相同，Quartz-seq2和Smart-seq2對所有細胞標記基因都能檢測出高表達水平，說明這兩種方法具有更高的細胞類型識別能力。
  d, Average log(expression) values of cell-type-specific reference markers for down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells. e,Average log(expression) values of cell-type-specific reference markers for down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells.

對于細胞圖譜項目，往往由于使用不同的測序方法會生成多套數據，文章還測試了先把所有數據整合在一起然后進行聚類分析細胞類型，考察了數據整合分析的可行性。

 
Integration of sc/snRNA-seq methods. a–d, UMAP visualization of cells after integrating technologies for 18,034 human (a,b) and 7,902 mouse (c,d) cells. Cells are colored by cell type (a,c) and sc/snRNA-seq protocol (b,d). e,f, Barplots showing normalized and method-corrected (integrated) expression scores of cell-type-specific signatures for human HEK293T cells, monocytes, B cells (e), and mouse secretory and TA cells (f). Bars represent cells and colors methods. g,h, Evaluation of method integratability in human (g) and mouse (h) cells. Protocols are compared according to their ability to group cell types into clusters (after integration) and mix with other technologies within the same clusters. Points are colored by sequencing method.

 

這篇文章的信息量非常大，作者還提到了諸如Smart-seq2這樣的成本較高的單細胞測序方法，可以通過微縮化的方式去降低成本，這點在SPT Labtech的mosquito納升級液體工作站上可以完美實現。
 

通過體外轉錄方式擴增cDNA比基于PCR的方法產生的PCR偏好性更小，這也解釋了CEL-seq2的在檢測靈敏度等方面都表現出的良好性能。
 

文章中使用的13種scRNA-seq方法包括 CEL-seq2、MARS-seq、Quartz-seq2、gmcSCRB-seq、Smart-seq2、ddSEQ、ICELL8、C1HT-small、C1HT-medium、Chromium、Chromium (sn)、Drop-seq、inDrop。這也是大家耳熟能詳的單細胞測序方法。

值得一提的是文章中使用的CEL-seq2檢測方法，使用了mosquito進行5倍微縮化的CEL-seq2單細胞cDNA合成，這也是德國馬克斯普朗克研究所優化的CEL-Seq2 protocol（mCEL-seq2）。使用mosquito添加160nL裂解液和240nL RT mix，cDNA第一鏈合成僅在400nL體系內進行。
 

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