Octet
雙特異性抗體（BsAbs）是同時可以結合兩個靶點的抗體藥物，可以將效應細胞直接作用于靶向腫瘤細胞，提高抗體的選擇性，改善藥物的安全性和有效性。與兩種單抗混合治療相比，雙特異性抗體可以降低開發和臨床成本，是當下抗體藥物開發的香饃饃。預測2025年雙特異性抗體全球市場規模將達到80億美元【1】。美國FDA在2021年5月底頒布了最終版的《雙特異性抗體研發指導原則》【2】。

下面是此文的CMC quality consideration(生產工藝質量屬性研究)部分：

親和力（affinity）大家都很熟悉了，以前關于生物藥物活性的一些指導原則中經常出現。這次雙抗指導原則中的on-rate和off-rate是啥東東呢？“打開/關閉速率”？

當然不是，這兩個詞的正確描述是（雙特異性抗體與兩個抗原間的）“結合速率”與“解離速率”。

關于檢測on-rate和off-rate

兩個分子（A和B）的結合實際上是動態可逆的過程。A和B結合的同時，解離也同時發生，所以通常用結合速率與解離速率來表征其相互作用的速率，亦稱為動力學表征。

動力學表征參數包括：

· On-rate：結合速率常數, 用kon或者Ka表示。
該參數代表配體（A）和分析物（B）之間的結合速率。每1M的A分子和B分子每秒產生的復合物數量，單位為 M-1s-1。

· Off-rate：解離速率常數, 用koff或者Kd表示。
該參數反映了復合物（AB）每秒鐘發生解離的量的百分比。koff越大，解離越快，單位為s-1。

· KD：平衡解離常數，用KD表示。
KD代表了兩個分子相互作用結合能力的強弱，也就是我們通常所說的親和力（affinity），其數值等于Koff/Kon。


BLI技術是列入美國藥典
中的檢測動力學方法之一

應用基于BLI技術的Octet分子互作分析系統，能夠非標記、實時地檢測兩個或多個分子間的動力學參數。常規方法如下：先將A分子（配體）固化在傳感器上，然后通過和B分子（分析物）的相互結合\解離這兩個步驟來獲取這些參數。

第一個步驟是結合，即將固化了A分子的傳感器浸入到含有B分子的溶液中進行結合反應，通過特異性結合生成AB復合物。
第二步是將含有AB復合物的傳感器浸入到不含B分子的緩沖溶液中進行解離。分析軟件將根據實時的結合/解離曲線分析得到kon和koff值。

親和力（KD）的數值通常用ELISA這些傳統技術也能獲得。而動力學參數Kon和Koff就只能通過以BLI技術為代表的實時非標記檢測技術來進行檢測。目前BLI技術已經被美國藥典列為動力學表征的互作方法之一，詳見15年的等待！BLI技術正式列入《美國藥典》（USP-NF）。


on-rate和off-rate的重要性

為什么這次發布的指導原則提出需要提供on-rate和off-rate這兩個重要的參數呢？這個就要從BLI技術和傳統的ELISA等方法的差別說起。

· ELISA是終點法（End Point）檢測，無法獲得解離\結合速率快慢的過程信息，而這些信息往往比單一的親和力值（KD）更重要；

· BLI技術在偶聯配體時，可以避免疏水包被導致的抗原表位喪失；

· BLI技術可以很好的檢測nM~pM范圍內的親和力，而且重復性好；

· 整個檢測過程無需洗滌步驟，特別適合檢測解離較快的弱結合。

· Octet自動化，節約大量人工成本，比如Octet RED384和HTX還可以整合機械臂。

在雜交瘤上清中用Octet的傳感器固化不同抗體，對同一濃度的抗原進行結合解離的曲線，綜合考慮On-rate和off-rate對抗體進行評估


Octet檢測雙特異抗體案例分享

目前已經有很多篇文章或者專利用Octet檢測雙抗的親和力，這里陳老濕就引用NIH（美國國立衛生研究院）的一篇文章以供大家學習【3】。該作者設計了一些HIV的中和抗體，其中一種名為VRC07 X 10E8的雙特異抗體可以同時識別CD4和gp41的MPER（近膜結構域）兩種抗原，其VRC07針對CD4，而10E8針對MPER。

用AHC（anti-human Fc）傳感器固化抗體，檢測CD4和MPER，發現雙特異抗體的親和力與母本的一致。

用SA或者AR2G固化CD4，然后依次結合雙特異抗體和MPER，發現雙特異抗體可以同時和兩個抗原結合。



另外，這次發布的雙抗開發指導原則的CMC quality consideration內容中，還提到需要檢測同源二聚體的污染物，Octet對此有專門的應用方案，文末有下載哈！

該指導原則強調了koff和kon動力學檢測的重要性。簡而言之就是僅僅做親和力表征已經不夠用啦，還要檢測on-rate和off-rate這兩個動力學參數。不僅對雙特異性抗體如此，其他抗體藥物也要檢測與靶點或者Fc受體的動力學參數。由于傳統方法的各種局限性，基于動力學的檢測方法也會被越來越多地用于法規要求中。


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Octet檢測同源二聚體的污染物的方案

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-參考文獻-

[1]https://www.prnewswire.com/news-releases/global-bispecific-antibody-market-to-2025-drug-sales--clinical-pipeline-insights-with-an-8-billion-market-opportunity-300780848.html).

[2]Bispecific Antibody Development Programs Guidance for industry(FDA).

[3] Bispecific Antibodies Targeting Different Epitopes on the HIV-1 Envelope Exhibit Broad and Potent Neutralization. Journal of Virology. (2015). 89:24.