云序circRNA+m6A組合服務在多個修飾譜學發表的應用
研究背景
目前m6A修飾的研究如火如荼，共計發表文章已達3000+篇，且每年仍呈指數上漲的趨勢。針對m6A的研究主要包括兩大方面：（1）編碼RNA上m6A修飾調控表達；（2）非編碼RNA（包括lncRNA、circRNA、miRNA等）中m6A修飾調控下游表達。然而非編碼RNA發表的文獻還較少，目前針對非編碼RNA的研究仍具有非常廣闊的空間。云序生物現已發表多篇非編碼RNA研究文章，這次我們以云序客戶發表的circRNA+m6A方向文章為例，幫助老師掌握短平快發表5分circRNA修飾譜學文章思路。
案例解析
發表期刊：Journal of Cellular and Molecular Medicine
發表日期：2021年6月27日
影響因子：5.109
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Identification and characterization of N6-methyladenosine modification of circRNAs in glioblastoma
實驗背景：
膠質瘤是一種常見的腦腫瘤，約占所有原發性腦腫瘤的80%。最近的表觀遺傳學研究發現，RNA轉錄后修飾在調節細胞生長和代謝以及腫瘤的生物學行為中起著至關重要的作用。然而circRNA的m6A修飾在GBM發病機制中的作用仍然不清楚。
實驗設計：
本文通過m6A MeRIP-seq結合RNA-seq，分析了環狀RNA中m6A修飾在膠質瘤發展進程中的調控機制。本文思路設計如下：
實驗結果：
（1）甲基化水平整體分析
（2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發生差異甲基化修飾的circRNA，采用散點圖展示了差異甲基化修飾的circRNA。此外也分別展示了差異峰所在circRNA的基因組分布、長度分布以及染色體分布等信息。
（3）m6A MeRIP-seq和RNA-seq聯合分析
通過兩組學聯合分析發現在m6A修飾水平改變的基因中，有1298個表達上調，1905個下調。且m6A水平與circRNA表達呈正相關。分別采用散點圖、熱圖等展示了既發生差異甲基化又發生差異表達的基因。
（4）功能富集分析
分別對差異（上調或下調）的甲基化circRNA的來源基因進行GO和KEGG功能富集分析，從而從生物學功能的方向找出m6A修飾circRNA可能參與的功能通路，從生物學功能的角度解析m6A修飾circRNA對膠質瘤進程的調控。
（5）指標驗證
此外，本文通過MeRIP-qPCR驗證并結合臨床數據鑒定了5個相關分子（BUB1、C1S、DTHD1、F13A1和NDC80），這些分子可能是進一步研究m6A介導GBM發展的功能和機制的初步候選分子。
發表期刊：BMC Genomics
發表日期：2020年1月13日
影響因子：3.969
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Transcriptome-wide map of m6A circRNAs identified in a rat model of hypoxia mediated pulmonary hypertension
實驗背景：
低氧介導肺動脈高壓（HPH）是一種致命性疾病，目前尚無有效的治療方法。近期研究發現circRNA受m6A修飾的調控，而circRNA的m6A修飾在HPH中作用仍不清楚。
實驗設計：
本文通過m6A MeRIP-seq結合RNA-seq，分析了環狀RNA中m6A修飾在HPH中的調控機制。本文思路設計如下：
實驗結果：
（1）甲基化水平整體分析
m6A MeRIP-seq測序后采用熱圖展示了每個樣品中基因甲基化修飾水平，箱圖從整體上展示了正常組樣品和HPH組樣品中的甲基化水平。m6A修飾在環狀RNA類型上的偏好性以及每個circRNA外顯子上m6A修飾的位點數也做了餅圖和柱狀圖的展示。這部分結果從整體上展示了正常組織和HPH組織circRNA上m6A的修飾情況，為后續研究進行鋪墊。
（2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發生差異甲基化修飾的circRNA，針對上調、下調相關circRNA進行長度及染色體分布特征分析，并分別用韋恩圖、散點圖以及累計分布圖展示了兩組間差異甲基化修飾情況。為篩選靶標基因提供基礎。
（3）m6A MeRIP-seq和RNA-seq聯合分析
通過兩組學聯合分析采用散點圖展示了既發生差異甲基化又發生差異表達的基因情況。針對上述circRNA來源基因進行了GO和KEGG富集分析，將m6A修飾差異且表達差異的circRNA來源基因轉化為具有生物學意義的通路富集基因，從而進一步對其功能進行了解，有利于后續指標的篩選。
（4）網絡構建
為探索受m6A修飾調控的circRNA的作用機制，研究者從與PH過程有關的miRNA入手進行了 circRNA-miRNA-mRNA網絡構建，從而確定了兩個與研究密切相關的circXpo6和circTmtc3。
（5）指標驗證
為確定circRNA在兩組間差異表達且發生差異m6A修飾，作者進行了circRNA結構及表達量鑒定，此外通過MeRIP-qPCR對其修飾水平也進行了鑒定。這一結果說明m6A修飾調控的circRNA的表達可能參與到HPH的發展過程中。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
MeRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制
目前m6A修飾的研究如火如荼，共計發表文章已達3000+篇，且每年仍呈指數上漲的趨勢。針對m6A的研究主要包括兩大方面：（1）編碼RNA上m6A修飾調控表達；（2）非編碼RNA（包括lncRNA、circRNA、miRNA等）中m6A修飾調控下游表達。然而非編碼RNA發表的文獻還較少，目前針對非編碼RNA的研究仍具有非常廣闊的空間。云序生物現已發表多篇非編碼RNA研究文章，這次我們以云序客戶發表的circRNA+m6A方向文章為例，幫助老師掌握短平快發表5分circRNA修飾譜學文章思路。
案例解析
文章1：膠質母細胞瘤circRNA m6A修飾表達譜
發表日期：2021年6月27日
影響因子：5.109
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Identification and characterization of N6-methyladenosine modification of circRNAs in glioblastoma
實驗背景：
膠質瘤是一種常見的腦腫瘤，約占所有原發性腦腫瘤的80%。最近的表觀遺傳學研究發現，RNA轉錄后修飾在調節細胞生長和代謝以及腫瘤的生物學行為中起著至關重要的作用。然而circRNA的m6A修飾在GBM發病機制中的作用仍然不清楚。
實驗設計：
本文通過m6A MeRIP-seq結合RNA-seq，分析了環狀RNA中m6A修飾在膠質瘤發展進程中的調控機制。本文思路設計如下：
（1）甲基化水平整體分析
本研究通過m6A MeRIP-seq測序采用餅圖、韋恩圖、motif圖等形式展示了膠質母細胞瘤(GBM）組織和正常大腦皮質組織中circRNAs的整體m6A修飾情況。
分析比較兩組間發生差異甲基化修飾的circRNA，采用散點圖展示了差異甲基化修飾的circRNA。此外也分別展示了差異峰所在circRNA的基因組分布、長度分布以及染色體分布等信息。
通過兩組學聯合分析發現在m6A修飾水平改變的基因中，有1298個表達上調，1905個下調。且m6A水平與circRNA表達呈正相關。分別采用散點圖、熱圖等展示了既發生差異甲基化又發生差異表達的基因。
分別對差異（上調或下調）的甲基化circRNA的來源基因進行GO和KEGG功能富集分析，從而從生物學功能的方向找出m6A修飾circRNA可能參與的功能通路，從生物學功能的角度解析m6A修飾circRNA對膠質瘤進程的調控。
此外，本文通過MeRIP-qPCR驗證并結合臨床數據鑒定了5個相關分子（BUB1、C1S、DTHD1、F13A1和NDC80），這些分子可能是進一步研究m6A介導GBM發展的功能和機制的初步候選分子。
文章2：缺氧介導的肺動脈高壓大鼠模型中circRNA m6A甲基化綜合分析
發表日期：2020年1月13日
影響因子：3.969
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Transcriptome-wide map of m6A circRNAs identified in a rat model of hypoxia mediated pulmonary hypertension
實驗背景：
低氧介導肺動脈高壓（HPH）是一種致命性疾病，目前尚無有效的治療方法。近期研究發現circRNA受m6A修飾的調控，而circRNA的m6A修飾在HPH中作用仍不清楚。
實驗設計：
本文通過m6A MeRIP-seq結合RNA-seq，分析了環狀RNA中m6A修飾在HPH中的調控機制。本文思路設計如下：
（1）甲基化水平整體分析
m6A MeRIP-seq測序后采用熱圖展示了每個樣品中基因甲基化修飾水平，箱圖從整體上展示了正常組樣品和HPH組樣品中的甲基化水平。m6A修飾在環狀RNA類型上的偏好性以及每個circRNA外顯子上m6A修飾的位點數也做了餅圖和柱狀圖的展示。這部分結果從整體上展示了正常組織和HPH組織circRNA上m6A的修飾情況，為后續研究進行鋪墊。
（2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發生差異甲基化修飾的circRNA，針對上調、下調相關circRNA進行長度及染色體分布特征分析，并分別用韋恩圖、散點圖以及累計分布圖展示了兩組間差異甲基化修飾情況。為篩選靶標基因提供基礎。
通過兩組學聯合分析采用散點圖展示了既發生差異甲基化又發生差異表達的基因情況。針對上述circRNA來源基因進行了GO和KEGG富集分析，將m6A修飾差異且表達差異的circRNA來源基因轉化為具有生物學意義的通路富集基因，從而進一步對其功能進行了解，有利于后續指標的篩選。
為探索受m6A修飾調控的circRNA的作用機制，研究者從與PH過程有關的miRNA入手進行了 circRNA-miRNA-mRNA網絡構建，從而確定了兩個與研究密切相關的circXpo6和circTmtc3。
為確定circRNA在兩組間差異表達且發生差異m6A修飾，作者進行了circRNA結構及表達量鑒定，此外通過MeRIP-qPCR對其修飾水平也進行了鑒定。這一結果說明m6A修飾調控的circRNA的表達可能參與到HPH的發展過程中。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
- m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA測序
- m6A miRNA測序
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
MeRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制
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