想調整研究方向，獲得學術研究突破口？想獲得論文選題思路，提高發文命中率？你需要了解學科發展態勢和未來走向！賽業生物專欄《Gene of the Week》每周二會根據熱點研究領域介紹一個基因，詳細為您介紹基因基本信息、研究概況和應用背景等，助您保持學術研究敏銳度，提高科學研究效率，期待您的持續關注哦。今天我們要講的主角是NLRP3及其突變導致的家族性冷自身炎癥綜合征。

NLRP3基因簡介
Nlrp3基因編碼一個pyrin樣蛋白，蛋白包含一個pyrin結構域，一個核苷酸結合位點(NBS)結構域和一個富亮氨酸重復序列(LRR)基序。該蛋白與凋亡相關的斑點樣蛋白PYCARD/ASC相互作用，PYCARD/ASC包含一個caspase招募域，是NLRP3炎癥小體復合體的成員。該復合物作為NF-kappaB信號的上游激活因子，并在炎癥、免疫反應和細胞凋亡的調節中發揮作用。
 

圖1. 炎癥小體的分子機制示意圖[1]

IL-1β，也稱為內源性熱原，是一種高度炎癥細胞因子，其產生受到至少三個不同步驟的嚴格控制。第一步涉及pro-IL-1β蛋白（p35）的產生；隨后裂解pro-IL-1β前體以產生活性 IL-1β 蛋白 (p17)，最后將 IL-1β 釋放到細胞外環境中。中間步驟，即 pro-IL-1β 的加工，涉及激活 caspase-1 激活復合物，其最佳特征是炎癥小體。NLRP3 炎癥小體將無活性的 pro-caspase-1 加工成有活性的 Caspase-1，它將pro-IL-1β裂解為成熟的 IL-1β，導致炎癥和細胞過早死亡。

編碼 Cryopyrin 的基因NLRP3的顯性遺傳突變被證明是導致一系列炎癥疾病的原因，包括家族性感冒自身炎癥綜合征 (FCAS)、Muckle -Wells 綜合征 (MWS) 和新生兒多系統炎癥性疾病 (NOMID) ，現在統稱為冷熱蛋白相關周期性綜合征 (CAPS)。
 

表1. FCAS的基本信息

備注：標有√的意為賽業紅鼠資源庫有該種保存狀態的小鼠

家族性冷自身炎癥綜合征
家族性冷自身炎癥綜合征 (FCAS)，是一種罕見的遺傳性炎癥性疾病，其特征是間歇性發作的皮疹、發熱、關節痛和其他因暴露于寒冷而引發的全身性炎癥的體征/癥狀FCAS的發病發生在嬰兒期和幼兒期，并在患者的一生中持續存在。FCAS通常在常染色體顯性遺傳條件下遺傳，并且是由編碼冷蛋白(NALP3)蛋白的CIAS1/NLRP3基因中的雜合突變引起的。假設該基因的突變會導致含有冷蛋白的蛋白質復合物的活性增加。這種蛋白質復合物被稱為炎癥小體，可調節體內炎癥。炎癥小體活性增加導致稱為IL-1ß的蛋白質釋放增加，從而導致炎癥癥狀，如發燒和關節痛。

由于FCAS是一種新發現的疾病，目前很難確定該疾病的實際發病率和患病率。新生兒多系統炎性疾病(NOMID)和Muckle-Wells綜合征 (MWS) 癥狀可能與FCAS的癥狀相似，并且存在顯著的表型重疊。家族性冷自身炎癥綜合征1 (FCAS1) 是由NLRP3基因中的雜合突變引起，位于染色體1q44。另外FCAS2由染色體19q13上的 NLRP12基因突變引起；FCAS3由染色體16q23上的PLCG2基因突變引起；FCAS4由染色體2p22上的NLRC4基因突變引起。
 

圖2. 冷卟啉相關周期性綜合征(CAPS)的臨床譜[2]
 

表2. FCAS疾病相關信息

Nlrp3基因編輯小鼠表型

1. 點突變模型
丙氨酸 352 到纈氨酸 (A352V) 和亮氨酸 353 到脯氨酸 (L353P) 的突變分別與經典 MWS 和 FCAS 患者密切相關，而在重疊綜合征患者中則不太相關。通過ES打靶技術生成兩個點突變小鼠模型：Nlrp3 A350V 和Nlrp3 L351P。因內含子中Neo的存在，阻斷了基因的正常表達，通過交配不同啟動子下表達Cre重組酶的小鼠介導Neo在不同部位刪除并表達突變基因。
 

圖3. Nlrp3 點突變小鼠打靶策略[3]

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（胚胎期刪除Neo并表達突變基因）幼崽在出生后 1-2 天或之前表現出炎癥表型，在第 4 天出現皮膚膿腫，并出現鱗屑狀紅斑（圖3A）。此外，這些小鼠在第 4 天表現出明顯的生長延遲，缺乏色素沉著和毛發生長。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髓細胞系刪除Neo并表達突變基因)幼崽表現出相似的表型，但具有不同的死亡率動力學，因此這些小鼠中有 70% 存活到第 7-9 天，然后以增加的速度死亡。
 

圖4. Nlrp3 點突變小鼠相關表型數據[3]

雖然與 MWS 患者中觀察到的蕁麻疹樣病變不同，但在表達 A350V 的幼崽中觀察到的皮膚紅斑、膿腫和鱗屑表明存在潛在炎癥。突變小鼠總體白細胞計數僅輕度升高，但中性粒細胞和血小板增多是明顯的。在 CAPS 患者中一致描述了類似的血液學和皮膚檢查結果。來自Nlrp3 A350V/+ / CreL幼崽的發炎皮膚切片進行了 IL-1β 和 IL-6 的免疫組織化學。兩種細胞因子（主要在真皮中的 IL-1β 和表皮中的 IL-6）的表達增加，與來自 CAPS 患者的皮膚活檢一致，并暗示這些細胞因子在皮膚病理學中的作用。TNFα 沒有顯著差異，這與先前描述的 CAPS 患者一致。
 

圖5. Nlrp3 點突變小鼠血清和皮膚中多種細胞因子上調[3]

2. 敲除小鼠模型
通過ES打靶技術生成Nlrp3 （Cias1)敲除小鼠模型，通過在ATG起始位置處插入EGFP達到敲除的目的：
 

圖6. Nlrp3基因敲除小鼠打靶策略[5]

野生型、Nlrp3+/-和Nlrp3-/-巨噬細胞產生相當數量的 pro-IL-1β，然而，與它們的野生型對應物不同，Nlrp3-/-巨噬細胞在 ATP 處理后沒有切割 pro-IL-1β，表明，cryopyrin 對于 ATP 誘導的 caspase-1 激活至關重要；用 LPS或 Pam3CSK4 引發的野生型巨噬細胞響應尼日利亞菌素或 maitotoxin分泌IL-1β和IL-18，相比之下，Asc-/-和Nlrp3-/-巨噬細胞均未釋放顯著的IL-1β或IL-18。

CAPS的治療
在大多數情況下，CAPS 由NLRP3基因突變引起。改變的基因產物cryopyrin激活炎癥小體，導致IL-1β的過度產生。IL-1β 導致 CAPS 的炎癥表現。IL-1 抑制劑是安全有效的治療選擇，隨著 IL-1 抑制劑的出現，為這種破壞性疾病提供了安全有效的治療選擇。

非甾體抗炎藥常用于緩解關節疼痛。高劑量的皮質類固醇已被證明在一定程度上有效，但可能會引起短期和長期的副作用。

Regeneron Pharmaceuticals 的 Arcalyst (Rilonacept) 是一種IL-1 阻滯劑，于 2008 年獲得 FDA 批準用于治療成人和 12 歲及以上兒童的 CAPS，包括 FCAS 和 MWS。

諾華制藥的 Ilaris (Canakinumab)，一種針對IL-1β 的單克隆抗體。2009 年被 FDA 批準用于治療患有 CAPS 的兒童和成人，包括 FCAS 和 MWS。

Biovitrum Pharmaceuticals 的 Kineret (Anakinra) 是一種 IL-1 受體拮抗劑，已廣泛用于 FCAS 患者，臨床效果極佳。然而，它目前未被 FDA 批準用于治療 FCAS 或任何 CAPS 疾病。

小結
未來的研究將需要解決cryopyrin中的激活突變如何規避炎癥小體的正常調節以產生炎癥性疾病，如家族性感冒自身炎癥綜合征、Muckle-Wells綜合征和新生兒多系統炎癥性疾病。一個有趣的可能性是低水平的細菌感染加上失調的冷熱蛋白反應會引發與這些疾病相關的癥狀。

參考文獻：
1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.

2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.

3. Kuemmerle-Deschner JB, Haug I. Canakinumab in patients with cryopyrin-associated periodic syndrome: an update for clinicians. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2013 Dec;5(6):315-29. doi: 10.1177/1759720X13502629. PMID: 24294305; PMCID: PMC3836377.

4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.

5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.