2020年，CRISPR/Cas9技術成功摘下諾獎桂冠，成為當下最熱門的基因編輯技術。CRISPR/Cas9在醫(yī)學領域具有強大的潛力，已經在多種基因疾病上顯示出強大的治療效果。

2021年3月，Integrated DNA Technologies(埃德特生物，以下簡稱IDT)聯(lián)合美國斯坦福大學、貝勒醫(yī)學院等全球知名機構的研究人員在國際頂級學術期刊Nature Medicine（影響因子：36.130）發(fā)表重磅研究論文，利用IDT公司的Alt-R® CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)和Lonza的電轉染系統(tǒng)，成功在小鼠模型中實現用β-珠蛋白替代α-珠蛋白來治療β-地中海貧血。

在這項研究中，研究人員使用LONZA 4D-Nucleofector對β-地貧來源CD34+ HSPC進行電穿孔，然后利用AAV6作為載體將IDT公司的Cas9結合化學合成的sgRNA遞送至HSPC進行基因編輯，在保持高度同源HBA2基因的同時，將內源性HBA1基因敲除并替換成全長HBB基因。

研究結果顯示：該基因編輯策略使得β-球蛋白：α-球蛋白信使RNA和蛋白質比率正常化，能夠產生功能性的成年血紅蛋白四聚體；在小鼠模型體內回輸后，經過基因編輯的HSPC能夠在小鼠中進行長期和雙系造血重建。提示HBB替代HBA1可以作為治療β-地中海貧血的新型治療策略。

 
研究人員表示，這項研究可能是首次證明在Cas9介導的DNA雙鏈斷裂（DSB）下，能夠實現整個內源性基因替換。該發(fā)現有望能夠拓展CRISPR/Cas9的應用范疇，以治療更多基因突變導致的疾病類型。
 

突破傳統(tǒng)CRISPR/Cas9的局限性
 
近年來，CRISPR基因編輯技術已經廣泛應用于許多領域，可以預見的是基于CRISPR的基因組編輯技術轉化為醫(yī)學應用會對人類健康產生重大影響，而此技術也引領了分子生物學工具的一場革命。
 
但是CRISPR/Cas9目前仍然存在一些局限性，限制了CRISPR/Cas9的快速發(fā)展，例如脫靶效應。同時，傳統(tǒng)CRISPR/Cas技術在基因切割上具有強大的優(yōu)勢，但是在長片段DNA精確的靶向插入/替換上依然存在一定的挑戰(zhàn)。
 
為了克服這些問題，IDT公司開發(fā)了Alt-R® CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，在降低整體脫靶率的同時實現在目標靶點的高效切割。同時在最新發(fā)表的研究中，顯示出這種新型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠將長片段的功能性基因插入/替換致病性基因。
 
Alt-R® CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)主要采用遞送核糖蛋白復合物(Ribonucleoprotein complex，RNP)的方法，RNP即Cas9蛋白和gRNA結合形成的具有編輯功能的復合物。與傳統(tǒng)CRISPR/Cas9不同的是，在IDT公司Alt-R®CRISPR 系統(tǒng)中，gRNA的組成成分crRNA和tracrRNA均經過優(yōu)化。
 
事實上，在2018年發(fā)表于期刊Nature Medicine上的另一篇研究文獻中，證實了Alt-R® CRISPR/Cas9的優(yōu)越性能。在該研究中，IDT公司的 Alt-R® S.P. HiFi Cas9呈現出穩(wěn)定的中靶編輯活性，脫靶率極低。

研究顯示：HiFi Cas9/AAV6能夠在5個治療位點（HBB、IL2RG、CCR5、HEXB、TRAC）誘導強大的基因編輯，具有高靶向性；同時HiFi Cas9/AAV6介導鐮狀細胞疾病（SCD）患者HSPC中p.E6V突變的高水平校正。
通過化學合成的高度定制化的引導RNA（gRNA）序列，配套使用的電轉/敲入增強子，各類對照試劑以及免費使用的序列設計工具，實現了從實驗設計到結果分析的全流程覆蓋，實現高效精準的基因編輯，讓實驗不再困難。 
 

Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 是丹納赫集團（Danaher Corporation，紐約證交所代碼：DHR）生命科學平臺旗下的一家運營公司。IDT致力于面向生命科學界開發(fā)、生產并銷售核酸產品，為學術與商業(yè)研究、農業(yè)、醫(yī)療診斷和藥物開發(fā)等領域提供支持。IDT 開發(fā)了多項針對基因組應用的技術，涵蓋二代測序、CRISPR基因組編輯、合成生物學、數字PCR以及RNA干擾。通過GMP服務，IDT生產的產品被科學家用于研究多種形式的癌癥以及各類遺傳性和傳染性疾病，為超過130,000名生命科學研究人員提供服務，也是公認的定制核酸生產行業(yè)的領導者。
 

Lonza公司的Nucleofector技術輕松實現CRISPR高效轉導
 
CRISPR技術作為除ZFN和TALEN技術外另一種有效的位點特異性基因組修飾的工具。而如何將CRISPR系統(tǒng)高效的轉導到目的細胞中，成了另一個亟待解決的問題。Lonza獨有的Nucleofector技術已有20年的歷史，自2001年問世以來得到廣泛的客戶認可，已經被證明可作為基于CRISPR的基因組編輯工具的有效非病毒轉染方式。Nucleofector技術使用預優(yōu)化的電轉參數和細胞類型特異性電轉液的組合，以使得底物能夠直接轉染到細胞核中。與傳統(tǒng)電轉相比，直接轉染到細胞核中，與細胞分裂無關，即使在非分裂的原代細胞中也具有較高的轉染效率。Nucleofector技術按照模塊化將小體積轉染及大體積轉染，可以實現在小體積到大體積的線性放大，適用于從藥物研發(fā)階段到臨床階段的轉化。