近期，美國康奈爾大學 Samie R. Jaffrey 研究組在 Cell 上發表了題為 “A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m⁶A-Modified mRNA” 的研究，揭示了 YTHDF 蛋白調節 m⁶A 修飾的 mRNA 的功能統一模型。

與“不同的 m⁶A 位點結合不同的 DF 蛋白”的主流觀點不同，該研究人員發現，所有 m⁶A 位點與三個 DF 蛋白都以基本相似的方式結合，它們以冗余的作用方式誘導同一子集的 mRNA 降解，沒有證據表明它們能直接促進翻譯。

圖 1. YTHDF 蛋白調控 m⁶A 修飾的 mRNA 的功能模型
m⁶A (N6-methyladenosine)：是指腺嘌呤核苷 N6 位置發生了甲基化修飾。m⁶A 是真核 mRNA 最普遍的內部修飾，在功能上調節真核轉錄組，影響 mRNA 的剪接、輸出、定位、翻譯和穩定性。
m⁶A 修飾有三類調節器：
Writer 甲基轉移酶 (MTC)，負責催化，例如 METTL3、METTL14 和 WTAP；
Eraser 去甲基化酶 (Demethylase)，負責去除甲基化，例如 FTO 和 ALKBH5；

Reader 直接識別和結合 m⁶A 位點，使 m⁶A 修飾的 RNA 發揮特定的作用，主要包括 YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 等。

YTHDF：一種 m⁶A “閱讀器”，即 Reader。胞質中的 YTHDF 家族包括了 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 三種旁系同源物 (paralogs)，也可以簡稱為 DF1、DF2、DF3。據報道，三種 DF 有不同的功能，DF1 促進 mRNA 的翻譯，DF2 促進 mRNA 的降解，DF3 促進翻譯和降解。

關于 DF 旁系同源物選擇性地結合不同的 m⁶A 位點的機制目前尚未清楚。此外，DF 蛋白功能差異的機制基礎也仍不清楚，尤其是在它們同源性很高的情況下。

圖 2. 研究亮點

 

首先，研究人員觀察 DF1 和 DF2 YTH 結構域與含有 m⁶A 的 RNA 的結合，發現在整個轉錄組中，DF 蛋白結合 m⁶A 的氨基酸以及結合近端的氨基酸都是保守的，因此三個 DF 蛋白與 m⁶A 結合的結構機制是相同的。

 

DF 旁系同源物結合 m⁶A 序列基序 (Sequence motifs) 的差異反映可以其結合特性，研究發現 m⁶A 殘基幾乎只存在 DR-m⁶A-CH (D = A, G, U; R = A, G; H = A, C, U) 這一個高度保守的序列基序中，像 GG-m⁶A-CU、AG-m⁶A-CU 都屬于 DR-m⁶A-CH 的亞基序 (Submotif) 。

 

為了確定每種 DF 的結合偏好，研究人員通過全轉錄組 iCLIP 圖譜，檢測了 HEK293T 細胞內源性表達的 DF1、DF2 和 DF3 的結合位點，分析發現三種 DF 結合位點序列亞基序的偏好相同。再結合已報道的 PAR-CLIP 數據，發現即使用不同的細胞系和不同的 CLIP 方法，DF 旁系同源物的 RNA 結合基本相同。因此， DF 旁系同源物的 m⁶A 結合模式相同。

圖 3. DF 蛋白與 m⁶A 結合位點的轉錄組分析

 

但是，不同的 DF 如何對 m⁶A-mRNAs 發揮不同的分子效應這個問題仍未解決，研究人員又分析了 DF 旁系同源物之間的效應區域差異，以及它們的相互作用蛋白 (不同的 DF 蛋白可能通過與不同的蛋白相互作用介導其不同的功能)。結果顯示，DF 旁系同源物的序列、功能域、相互作用蛋白和細胞內定位都高度相似。

 

此外，研究人員還發現 DF 蛋白與降解有關的因子相互作用可信度較高，與翻譯相關的因子相互作用可信度較低。

 

根據已有報道，研究人員考慮到每種 DF 蛋白都有介導 m⁶A-mRNA 降解的可能性。于是，他們利用 siRNA 選擇性敲降 HeLa 細胞中的 DF1、DF2 和 DF3，使用 RNA-seq 檢測 mRNA 的豐度，證實是 DF2 影響了 m⁶A-mRNA 穩定性，而非 DF1 或 DF3。

圖 4. DF 蛋白冗余地控制 m⁶A-mRNA 的豐度和穩定性

再對 DF 進行不同組合的雙重敲降和三重敲降，并利用放線菌素 D (Actinomycin D) 抑制轉錄后 m⁶A-mRNA 的水平證明了：DF 蛋白的聯合活性導致 m⁶A 修飾的 mRNA 降解，DF 旁系同源物在功能上可以互相補償，這種補償功能也受其表達水平限制。當三種 DF 都耗竭時，補償就不會發生，這時 m⁶A-mRNA 的穩定性得到最大程度的提高。
接下來，研究人員檢測了 DF 在 m⁶A-mRNA 的翻譯調控中的作用。三種 DF 都與多聚核糖體組分無關，而富集于信使核糖核蛋白 (mRNP) 組分，該結果與 “DF 蛋白(任何一種) 穩定地結合至 mRNA 3'UTR，增強其翻譯的模型” 不一致。

任何的 DF 旁系同源物基因沉默都不影響 HeLa 細胞中 mRNA 的翻譯效率，即使是 DF 三重敲降也沒有顯著降低翻譯效率。因此，任何一種 DF 同源旁系物都不能直接增強 mRNA 的翻譯，相反的，它們的主要作用是介導 m⁶A-mRNA 降解。

圖 5. DF 蛋白冗余地抑制白血病細胞的分化

 

已有報道 DF2 在急性髓系白血病 (AML) 中過表達，與 AML 的發生和發展有關，DF2 的缺失導致一些抑制 AML 相關基因轉錄本上調，例如在 DF2 敲除的白血病前期細胞中，TNFRSF1B 轉錄本的半衰期增加，表面 TNFR2 的表達量上升。
為探索 TNFRSF1B 的抑制是否是通過三種 DF 蛋白共同作用介導，研究人員對 MOLM-13 白血病細胞中的 DF 進行單獨或聯合敲降，發現 TNFRSF1B mRNA 表達水平受 DF 的單獨敲降影響較小，其中僅 DF2 的敲降使其略微升高，在三重敲降后卻顯著上調。因此，在 MOLM-13 細胞中 DF 蛋白共同作用控制 m⁶A-mRNA 的表達水平。

 

相關抑制劑	作用
SAH	氨基酸衍生物和幾種代謝途徑中的調節劑。METTL3-METTL14 異二聚體復合物 (METTL3-14) 的抑制劑
3-Deazaadenosine	S-腺苷高半胱氨酸 (SAH) 水解酶抑制劑；通過抑制 SAH 水解來抑制 m6A 基團插入 mRNA 底物中
IOX1	甲基轉移酶 ALKBH5 抑制劑
FB23-2	有效、選擇性的 mRNA m6A 去甲基酶 FTO 抑制劑
FG-2216/IOX3	HIF-PHD 抑制劑；在體外對 FTO 有抑制作用
Rhein	可逆地與 FTO 催化結構域結合，并競爭性地阻止了對 m6A 修飾底物的識別
Entacapone	特異的外周活性的鄰苯二酚-O-甲基轉移酶 (COMT) 抑制劑；競爭性 FTO 抑制劑
Meclofenamic acid	非甾體類抗炎化合物；FTO 抑制劑

 

縮寫：

MTC: Methyltransferase complex
YTHDF: YT521-B homology domain-containing family/YTH domain family

 

原文閱讀：Sara Zaccara, et al. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA. Cell. 2020 Jun 25;181(7):1582-1595.e18.

參考文獻

↓ 下滑查看更多文獻

1. Sara Zaccara, et al. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA. Cell. 2020 Jun 25;181(7):1582-1595.e18.
2. Liuer He, et al. Functions of N6-methyladenosine and Its Role in Cancer. Mol Cancer. 2019; 18: 176.
3. Si‐Yu Liu, et al. m6A facilitates YTHDF‐independent phase separation. J Cell Mol Med. 2020 Jan; 24(2): 2070–2072.
4. Hailing Shi, et al. Where, when and how: context-dependent functions of RNA methylation writers, readers, and erasers. Mol Cell. Author manuscript; available in PMC 2020 May 16.
5. Jasmin Paris, et al. Targeting the RNA m6A Reader YTHDF2 Selectively Compromises Cancer Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Cell Stem Cell. 2019 Jul 3; 25(1): 137–148.e6.