MeRIP-Seq & RIP-Seq在肺動脈高壓m6A蛋白YTHDF1機制研究的應用
N6-甲基腺苷（m6A）是最普遍的mRNA內部修飾，通過甲基化酶（writer）、去甲基化化酶（eraser）和閱讀蛋白（reader）的合作參與細胞過程。m6A對mRNA下游調控如翻譯、輸出和穩定性的影響主要由識別修飾靶點的reader決定。云序客戶南京醫科大學陳峰課題組在American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 雜志（IF=21.405）上發表了關于m6A reader蛋白在肺動脈高壓（PAH）發病機制中作用的文章，展示了人類PAH患者和實驗性PH模型中m6A水平和YTHDF1 reader蛋白表達，YTHDF1 reader蛋白的機制作用，并表明針對YTHDF1或MAGED1的策略可能是治療PH的有效療法。云序生物有幸參與本項目當中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq以及生信分析。
下面我們就為大家解析這篇研究reader蛋白的文章思路和成果。
發表期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
發表日期：2021年5月1日
影響因子：21.405
研究方法：比色法檢測m6A整體水平、m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq、MeRIP-qPCR
文章鏈接：YTHDF1 Regulates Pulmonary Hypertension through Translational Control of MAGED1
首先，作者用比色法檢測了PAH患者（n=7）和Su/Hx誘導PAH小鼠的肺組織（n=8）、MCT誘導大鼠的肺動脈組織（n=8），發現與對應的健康組織相比整體m6A甲基化水平上調。同時，也發現在PAH組織中，m6A reader蛋白YTHDF1的表達上調。并且，YTHDF1蛋白表達量和RNA整體m6A水平都隨著缺氧時間一起增加。這些結果提示了YTHDF1與m6A修飾可能參與了PH病理生理過程。
二、YTHDF1基因敲除改善PH
為驗證YTHDF1對PH病理生理過程的影響，一方面作者在小鼠中敲降YTHDF1進行Su/Hx誘導PH實驗，通過血液動力學、肺動脈血管壁厚度和肌化、肺動脈平滑肌細胞增殖等指標，發現敲降YTHDF1可改善小鼠PH和PVR發展。另一方面，目前已知PASMC細胞表型轉化在PH的發病機制中起重要作用，作者在 HPASMC中敲降YTHDF1，發現可改善細胞增殖、表型轉換和凋亡抵抗。
三、YTHDF1蛋白表達增加與蛋白降解改變有關
有趣的是，作者發現雖然YTHDF1蛋白表達量在PH患者和動物模型中上調，但是YTHDF1的mRNA卻不變甚至輕微下調。于是作者通過轉錄抑制實驗和蛋白合成抑制試驗在HPASMCs中驗證到，缺氧誘導PH過程中YTHDF1轉錄本穩定性不變而蛋
四、MAGED1是Su/Hx處理小鼠m6A修飾和YTHDF1的靶點
為了尋找YTHDF1作用的靶基因，作者對Su/Hx誘發PH的小鼠和對照小鼠進行了m6A MeRIP-seq、RNA-seq和RIP-seq。m6A修飾譜展現了m6A位點多分布在終止密碼子，甲基化峰保守序列分析顯示RRACH序列顯著富集。對三組學差異基因取交集后進行了GO和KEGG分析。
圖片處理組m6A修飾水平上調且與YTHDF1結合的基因中，MAGED1基因的功能與細胞凋亡、分化和增殖相關，篩選其為潛在靶基因。與對照組相比，在Su/Hx處理小鼠中，作者通過MeRIP-qPCR驗證了MAGED1的m6A修飾水平升高，通過RIP實驗驗證到結合YTHDF1的MAGED1蛋白更加富集。另外，同樣進行Su/Hx處理，在敲降YTHDF1的小鼠MAGED1蛋白表達量低于野生型。這些結果表明，Su/Hx誘導PH的模型小鼠中，MAGED1蛋白經由m6A修飾受YTHDF1調控。
五、YTHDF1識別并促進m6A修飾的MAGED1 mRNA的翻譯
接下來作者探究了YTHDF1調控MAGED1的機制。作者觀察到在患者和小鼠模型中，MAGED1蛋白水平隨著促PH因子的作用而升高，但MAGED1基因mRNA卻沒有顯著差異。于是針對YTHDF1作者1) 通過RIP-qPCR發現缺氧誘導PH的小鼠中YTHDF1結合的MAGED1 mRNA更加富集; 2)通過敲降和過表達YTHDF1發現影響MAGED1蛋白表達而不是mRNA水平；3）通過CHX處理區分驗證了HPASMCs中過表達YTHDF1不改變MAGED1蛋白降解速率，說明YTHDF1是通過影響翻譯效率實現提高MAGED1蛋白表達。除此之外，作者還在過表達YTHDF1的HPASMCs中敲降了甲基化酶METTL3，發現會減弱YTHDF1促進MAGED1蛋白表達的效果。這些實驗結果證明，YTHDF1通過促進帶有m6A修飾的靶基因MAGED1的蛋白翻譯效率從而增強其蛋白表達。
六、靶基因MAGED1對PH的促進作用
最后作者研究了靶基因MAGED1對PH病理生理過程的影響。通過動物實驗和細胞實驗，驗證了敲降MAGED1對PH小鼠血管重塑和心功能損害具有保護作用，進一步又驗證了MAGED1通過上調PCNA促進缺氧狀態下PASMC的細胞增殖、遷移和存活。
下面我們就為大家解析這篇研究reader蛋白的文章思路和成果。
發表日期：2021年5月1日
影響因子：21.405
研究方法：比色法檢測m6A整體水平、m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq、MeRIP-qPCR
文章鏈接：YTHDF1 Regulates Pulmonary Hypertension through Translational Control of MAGED1
技術路線
研究內容
一、m6A修飾水平在人類PAH患者和實驗性PH模型中上調首先，作者用比色法檢測了PAH患者（n=7）和Su/Hx誘導PAH小鼠的肺組織（n=8）、MCT誘導大鼠的肺動脈組織（n=8），發現與對應的健康組織相比整體m6A甲基化水平上調。同時，也發現在PAH組織中，m6A reader蛋白YTHDF1的表達上調。并且，YTHDF1蛋白表達量和RNA整體m6A水平都隨著缺氧時間一起增加。這些結果提示了YTHDF1與m6A修飾可能參與了PH病理生理過程。
二、YTHDF1基因敲除改善PH
為驗證YTHDF1對PH病理生理過程的影響，一方面作者在小鼠中敲降YTHDF1進行Su/Hx誘導PH實驗，通過血液動力學、肺動脈血管壁厚度和肌化、肺動脈平滑肌細胞增殖等指標，發現敲降YTHDF1可改善小鼠PH和PVR發展。另一方面，目前已知PASMC細胞表型轉化在PH的發病機制中起重要作用，作者在 HPASMC中敲降YTHDF1，發現可改善細胞增殖、表型轉換和凋亡抵抗。
三、YTHDF1蛋白表達增加與蛋白降解改變有關
有趣的是，作者發現雖然YTHDF1蛋白表達量在PH患者和動物模型中上調，但是YTHDF1的mRNA卻不變甚至輕微下調。于是作者通過轉錄抑制實驗和蛋白合成抑制試驗在HPASMCs中驗證到，缺氧誘導PH過程中YTHDF1轉錄本穩定性不變而蛋
四、MAGED1是Su/Hx處理小鼠m6A修飾和YTHDF1的靶點
為了尋找YTHDF1作用的靶基因，作者對Su/Hx誘發PH的小鼠和對照小鼠進行了m6A MeRIP-seq、RNA-seq和RIP-seq。m6A修飾譜展現了m6A位點多分布在終止密碼子，甲基化峰保守序列分析顯示RRACH序列顯著富集。對三組學差異基因取交集后進行了GO和KEGG分析。
五、YTHDF1識別并促進m6A修飾的MAGED1 mRNA的翻譯
接下來作者探究了YTHDF1調控MAGED1的機制。作者觀察到在患者和小鼠模型中，MAGED1蛋白水平隨著促PH因子的作用而升高，但MAGED1基因mRNA卻沒有顯著差異。于是針對YTHDF1作者1) 通過RIP-qPCR發現缺氧誘導PH的小鼠中YTHDF1結合的MAGED1 mRNA更加富集; 2)通過敲降和過表達YTHDF1發現影響MAGED1蛋白表達而不是mRNA水平；3）通過CHX處理區分驗證了HPASMCs中過表達YTHDF1不改變MAGED1蛋白降解速率，說明YTHDF1是通過影響翻譯效率實現提高MAGED1蛋白表達。除此之外，作者還在過表達YTHDF1的HPASMCs中敲降了甲基化酶METTL3，發現會減弱YTHDF1促進MAGED1蛋白表達的效果。這些實驗結果證明，YTHDF1通過促進帶有m6A修飾的靶基因MAGED1的蛋白翻譯效率從而增強其蛋白表達。
六、靶基因MAGED1對PH的促進作用
最后作者研究了靶基因MAGED1對PH病理生理過程的影響。通過動物實驗和細胞實驗，驗證了敲降MAGED1對PH小鼠血管重塑和心功能損害具有保護作用，進一步又驗證了MAGED1通過上調PCNA促進缺氧狀態下PASMC的細胞增殖、遷移和存活。
總結
這篇文章首先通過比色法檢測了PH中整體m6A修飾水平上調，m6A reader蛋白YTHDF1表達上調，揭示了m6A修飾在PH病理生理學中的潛在作用。然后通過云序生物提供的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq尋找m6A修飾和受YTHDF1調控的靶基因MAGED1。在疾病患者、模型小鼠、PASMC細胞中，一方面驗證了YTHDF1 reader蛋白在疾病中表達提高，另一方面從結合mRNA、調控mRNA和蛋白表達水平等方面，驗證了YTHDF1通過m6A修飾促進靶基因MAGED1的蛋白表達。最后驗證了靶基因MAGED1對PH的促進作用。本研究首次將m6A水平和YTHDF1豐度的增加與PH的發展聯系起來，并表明針對YTHDF1或MAGED1的干預可能是治療PH的有效方法。
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