Nature 解鎖新機制，p53 與鐵死亡的關系
眾所周知，p53 是一種腫瘤抑制基因，被廣泛稱為“基因組的守護者”。自 1979 年被發現至今，p53 基因一直是分子生物學和腫瘤學的研究熱門。據 Elie Dolgin 在 Nature 上發表的 “The most popular genes in the human genome” 統計，截至 2017 年，PubMed 數據庫中研究最多的基因列表——一種人類基因組的“熱門基因”，TP53 榮得桂冠。
Gaurav Mendiratta 等人在 2021 年發表的“Cancer gene mutation frequencies for the U.S. population” 中，通過結合基因組 (所有癌癥中每個基因中包含一個或多個突變的估計比例) 和流行病學數據也統計了美國人群中基因突變的頻率，發現 TP53 是最常見的突變基因 (35%)。
圖 1 左：截至 2017 年，PubMed 數據庫中研究最多的基因列表[1] 圖 1 右：癌癥患者群體中重要基因組的流行病學加權基因突變比例[2]
p53 是一種抑癌基因，位于人的 17 號染色體的短臂上，可以編碼和表達 p53 蛋白。p53 可以被許多應激信號誘導后，以四聚體形式與 DNA 結合，然后以序列特異性方式參與到某些介導關鍵細胞過程基因的轉錄調控中，例如細胞周期停滯、DNA 修復、衰老和細胞凋亡。激活 p53 蛋白信號通路的方法之一是對 DNA 模板完整性的破壞。如圖 2，各種應激導致不同類型的 DNA 損傷，從而通過導致 p53 蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化或 sumolation 的翻譯后修飾。
圖 2. p53 蛋白作為腫瘤抑制因子的中心作用[4]
鐵死亡 (Ferroptosis)，是一種新型的調節性細胞死亡形式；其形態學特征是線粒體膜密度濃縮，線粒體嵴減少或消失，線粒體外膜破裂 (見：鐵死亡是什么，如何檢測？您要的“一文通”來了!)。p53 可以通過抑制 SLC7A11 的表達來增強鐵死亡。SLC7A11 是 System x- (抗氧化體系)的亞基，負責主要的轉運活性，抑制 System xc- 的活性會抑制胱氨酸的吸收，影響 GSH 的合成，繼而導致膜脂修復酶 GPX4 活性降低，使得細胞抗氧化能力降低，從而促進鐵死亡。
顧偉團隊早在 2015 年于 Nature 上發表的 “Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression” 中已證明 p53 通過抑制 SLC7A11 (胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白的關鍵成分) 的表達來抑制胱氨酸攝取，并且使細胞對鐵死亡敏感。
如圖 4，四環素處理對親代 H1299 細胞中 SLC7A11 的表達沒有明顯影響，但在四環素調控 (tet-on) p53 誘導的細胞系中發現，p53 激活嚴重降低了 SLC7A11 蛋白水平 (圖 4a)。當 p53 shRNA (p53 敲低)通過 Nutlin-3 (p53-MDM2 抑制劑) 處理，SLC7A11 蛋白質水平沒有受到明顯的影響 (圖 4b)。這些數據表明 SLC7A11 基因是 p53 介導的轉錄抑制的靶標。
隨后，作者團隊使用 p533KR 細胞進行實驗，這是一種無法誘導細胞周期停滯、衰老和凋亡的乙酰化缺陷突變體細胞。他們發現在沒有 Tet-on 誘導的情況下，p533KR 細胞對 Erastin 介導的鐵死亡具有很強的抵抗力，SLC7A11 的過表達會挽救 p533KR 依賴性細胞鐵死亡 (圖 4c)。此外，在體內外實驗中，SLC7A11 的過表達會大大減弱 p533KR 的腫瘤抑制作用 (圖 4d-e)。
a: Doxycycline 處理的 tet-on p53 穩定系細胞的蛋白質印跡；b: Nutlin 處理的 p53 敲低的 U2OS 細胞蛋白質印跡分析；c-d: 用對照或過表達 SLC7A11 的質粒轉染 Tet-on p533KR 細胞的鐵死亡情況以及細胞的異種移植腫瘤重量
另外作者團隊還發現高水平的活性氧 (ROS) 可以觸發 p53 介導的鐵死亡。
如圖 5a，單獨的 p533KR 誘導或 ROS 激活劑處理中均未觀察到明顯的細胞死亡；而 p533KR+ROS 組誘導了大量細胞死亡，SLC7A11 的過表達可以挽救這種死亡（5b）。
a-b: 四環素和 ROS 處理對照或過表達 SLC7A11 的質粒轉染 Tet-on p533KR 細胞的死亡情況；
■ ALOX12 是 p53 介導的鐵死亡途徑必不可少的
顧偉團隊深入研究，于 2019 年在 Nature Cell Biology 上發表了“ALOX12 is required for p53-mediated tumour suppression through a distinct ferroptosis pathway”文章，指出 ALOX12 介導的、不依賴 ACSL4 的鐵死亡途徑對 p53 介導的腫瘤抑制作用非常重要。ALOX12 基因位于人類染色體 17p13.1，這是人類癌癥中單等位基因缺失的熱門位點。
該團隊首先驗證了 ALOX12 對于 ROS 應激下 p53 介導的鐵死亡是必不可少的。他們發現 ALOX12 耗竭對 p53 水平或其轉錄靶標 (例如 SLC7A11、Mdm2 和 p21) 的表達沒有明顯影響，但可以挽救 p53 介導的鐵死亡 (圖 6a-b)。
隨后，他們發現在 ROS 應激下 p53 介導的鐵死亡獨立于 GPX4 調節。如圖 6c，在 GPX4 敲除細胞中可以檢測到高水平的內源性脂質過氧化，而 GPX4 異位表達后，脂質過氧化水平顯著降低。同時，RSL-3 (GPX4 抑制劑) 可以抑制 GPX4 對脂質過氧化的減少作用，而 p53 的激活對其沒有任何影響。
接著，作者團隊研究 ALOX12 對于 p53 介導的腫瘤生長抑制的影響。研究發現，四環素誘導的 p533KR 表達會顯著降低腫瘤細胞的生長；而 ALOX12 基因敲除會大大的抑制 p533KR 的腫瘤抑制作用。這表明 ALOX12 對 p53 的腫瘤細胞生長抑制活性至關重要。
a: U2OS 細胞的蛋白質印跡分析；b: 不同藥物處理 U2OS 細胞死亡情況；c: 細胞脂質過氧化水平的變化；d: H1299 Tet-on p533KR 和 ALOX12 敲除鼠的異種移植腫瘤情況。
■ iPLA2β 是 p53 介導的鐵死亡途徑的關鍵調節因子
今年 6 月，該團隊又在 Nature Communications 上發表了“iPLA2β-mediated lipid detoxification controls p53-driven ferroptosis independent of GPX4”，再次指出 iPLA2β 是在高 ROS 應激條件下 p53 激活誘導的鐵死亡的關鍵調節因子。同時，p53 以不依賴 GPX4 的方式誘導鐵死亡。
圖 7. ALOX12 和 iPLA2β 在調節 p53 介導的鐵死亡中的作用模型[16]
作者團隊發現 p53 以不依賴 GPX4 方式介導鐵死亡。
他們首先在 ACSL4/GPX4 雙基因敲除 (ACSL4-/-/GPX4-/-) 的人骨肉瘤細胞系 U2OS 中發現: p53 水平不受 ACSL4 和 GPX4 的影響，同時 p53 介導的 p21 轉錄激活或 SLC7A11 的抑制也基本沒有變化 (圖 8a)。然而，當 ACSL4-/-/GPX4-/- 細胞暴露于TBH 和 Nutlin 時，我們很容易能觀察到細胞鐵死亡，并且可以被鐵死亡抑制劑，特異性阻斷 (圖 8b)。
a: Nutlin 對 U2OS 細胞 p53 蛋白的影響；b: TBH、Nutlin、Ferr-1、Lipro-1、3-MA、Necrostatin-1、Z-VAD-FMK 對 WT 和 ACSL4-/-/GPX4-/- U2OS 細胞死亡的影響
總結：
抑癌基因 p53，在腫瘤領域的熱度，絕對是處于第一梯隊的。鐵死亡是一種新型的調節性細胞死亡形式，自被發現就引起了研究狂潮，熱度不減。p53 與鐵死亡結合的研究發現，拓展了 p53 新的調控腫瘤發展的機制，也為研究出腫瘤抑制作用的新型藥物開辟了新的方向。雖前路漫漫，但未來可期！
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參考文獻
1. Elie Dolgin, et al. The most popular genes in the human genome. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):427-431.2. Gaurav Mendiratta, et al. Cancer gene mutation frequencies for the U.S. population. Nat Commun. 2021 Oct 13;12(1):5961.
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15. Bo Chu, Wei Gu, et al. ALOX12 is required for p53-mediated tumour suppression through a distinct ferroptosis pathway. Nat Cell Biol. 2019 May;21(5):579-591.
16. Delin Chen, Wei Gu, et al. iPLA2β-mediated lipid detoxification controls p53-driven ferroptosis independent of GPX4. Nat Commun. 2021 Jun 15;12(1):3644.
