導讀

自青霉素發現以來，抗生素已經成為人類對抗細菌的最有效武器，挽救了無數人的生命，但隨著抗生素使用上的無節制，抗生素耐藥性已成為一個重大的全球問題。因此了解微生物對抗生素適應的分子機制成為抗擊抗生素耐藥性（AMR）的一個重要途徑。

近日，法國巴斯德研究所的科學家運用轉錄組測序、naica^®微滴芯片數字PCR等技術證實VchM（霍亂弧菌特有甲基轉移酶）參與應對氨基糖苷類抗生素的應激反應，這表明，DNA甲基化在氨基糖苷類抗生素的耐藥機制中也發揮著重要作用，該文章刊載于《PLOS GENETICS》。

應用亮點：

▶  運用naica^®微滴芯片數字PCR系統分析霍亂弧菌操縱子表達情況。

▶  VchM缺失會導致生長缺陷，但卻可以使霍亂弧菌對氨基糖苷產生應激。

▶  VchM直接調節groES-2（伴侶蛋白編碼基因）的胞嘧啶甲基化，從而改變其表達情況，影響霍亂弧菌耐藥性。

氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和新霉素）是一類針對細菌核糖體小亞基的抗生素，其破壞翻譯保真度，增加細胞中錯誤折疊蛋白質的水平。而本文的研究主要針對霍亂弧菌對其的耐藥性機理。科學家們在之前的研究中發現，特定DNA甲基轉移酶基因突變（VchM）的霍亂弧菌相比WT具有更強的耐藥性，這表明DNA甲基化可能在霍亂弧菌適應AGs中發揮作用。

VchM編碼一種Orphan m5C DNA甲基轉移酶，導致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，雖然VchM的缺失會導致生長缺陷，但霍亂弧菌細胞可以在亞致死濃度和致死濃度的抗生素下對氨基糖苷應激。

▲圖1：霍亂弧菌ΔVchM對亞致死濃度氨基糖苷的敏感性較低。GAs類，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（慶大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas類，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -內酰胺類西林），2.5 μg/ml

對于ΔVchM霍亂弧菌的轉錄組測序和遺傳分析發現，ΔVchM菌株中有4個直接參與蛋白質折疊的基因被上調。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。

通過naica^®微滴芯片數字PCR系統對基因表達進行驗證分析發現，ΔVchM霍亂弧菌中groES-2的表達在不同時期均有較大上調。進一步通過缺失驗證表明了groESL-2對ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。

▲圖2：ΔVchM菌株中groESL-2操縱子上調(對數生長期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指數生長期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)

在groESL-2區域觀察存在四個VchM甲基化基序存在。進一步對基序分析發現，破壞這些基序會導致groESL-2基因表達增加（如圖3）。且基序破環越多，則導致的表達上調更加明顯。同時，ΔVchM中的groESL-2基因表達一直高于基序突變，表明還存在其他因素與甲基化協同控制groESL-2表達。這些結果表明，在霍亂桿菌中，一組特定的伴侶蛋白編碼基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，將DNA甲基化與伴侶蛋白表達的調節和對抗生素的耐受聯系起來。

▲圖3：在WT中，groESL-2區域的VchM位點突變導致基因表達增加

法國巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年來一直走在世界科技前沿，是微生物學、免疫學、傳染病學等學科的起源地，曾開發出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黃熱病疫苗等多個造福人類的疫苗產品，并培養了10名諾貝爾獎生理學或醫學獎獲得者，實現研究、教育、健康、創新“四位一體”的研究機構。