基于EAD碎裂的生物制品關鍵質量屬性的MAM策略
Multi-Attribute Method(MAM)是基于質譜的一種自動化分析方法，可以實現在生物制品研發和生產過程中，用質譜方法一次進樣同時監測多個產品質量屬性（PQA），從而將質譜這一傳統意義上用于研發的分析技術，應用于產品放行。如何可信地表征生物制品的關鍵質量屬性（PQA）一直是生物制藥企業MAM技術的核心問題。基于碰撞誘導解離（CID）的MAM工作流程通常需要結合互補的MS/MS技術用于鑒定氨基酸同分異構體等PQA。傳統的ExD碎裂受限于過長的循環時間和低靈敏度，無法在單針進樣的情況下實現相關PQA的MAM分析流程，而基于全新電子活化解離（EAD）的MAM技術，單針進樣即可準確，快速，靈敏且可重現地分析生物制品的PQA，如氨基酸同分異構體等。
多質量屬性監測MAM：
MAM是一種功能強大的LC-MS方法，用于同時監測和量化生物制品的多個產品質量屬性（PQA）或關鍵質量屬性（CQA）。傳統意義上，基于CID的MS/MS被用作鑒定的第一步，然后使用基于MS或MS和MS/MS工作流進行量化。然而，基于CID的MS/MS方法不可能對發生脫酰胺化的肽段進行全序列確認，包括區分亮氨酸與異亮氨酸、天冬氨酸與異天冬氨酸（Asp vs. isoAsp）以及脆弱修飾（如糖基化）的定位。因此，基于CID的鑒定工作流程必須依賴于互補的MS/MS技術，在對所選物種進行量化之前，在單獨的實驗中使用其他更先進的儀器。我們可以使用基于EAD的平臺方法5,6解決這一挑戰，該方法能夠在單針進樣中使用MAM對PQA進行可靠、準確的識別、量化和監測（圖1）。
圖1：基于EAD的MAM工作流程。ZenoTOF 7600系統提供的EAD平臺方法1-4為序列確認和翻譯后修飾（PTM）的識別提供了可靠的肽圖結果，并能夠區氨基酸分異構體。這是MAM獲得這些PQA和CQA準確量化結果的先決條件。用于肽圖分析的Biologics Explorer軟件和用于PQA和CQA量化的符合合規要求的SCIEX OS軟件的結合，使基于EAD的MAM工作流成為一個簡化的單針進樣過程。
1 可靠的PQA識別和氨基酸異構體區分：單針進樣的EAD平臺方法可以區分氨基酸異構體和翻譯后修飾（PTM），這對傳統表征和MAM方法具有挑戰性。
2 簡化的數據流：可定制的PQA列表將Biologics Explorer軟件中的肽圖結果與符合合規性要求的SCIEX OS軟件將PQA量化和監測關聯起來。
3 強大的肽圖軟件：Biologics Explorer軟件為肽圖分析和PQA選擇提供了強大的算法和優化的工作流。
4 合規性：PQA量化和監控。
圖2：Biologics Explorer軟件結合合規軟件SCIEX OS的MAM工作流。在此流程中，使用Biologics Explorer軟件從EAD DDA數據的肽圖中非常可信地確定了mAb的PQA。選擇感興趣的PQA并將其導出到.txt文件，然后導入到使用SCIEX OS軟件的分析模塊創建的處理方法中。峰面積積分使用MQ4算法執行，然后創建用于相對PQA量化和監測的自定義模板。報告功能提供了許多用于自定義和選擇不同文件格式的選項，例如word文檔和pdf文檔。
分析模塊提供了充分的靈活性，可以在處理方法中構建自定義公式，用于計算PQA的豐度百分比7-8。圖3顯示了VVSV肽段PQA的量化結果，該結果是通過將帶有自定義公式的處理方法應用于NISTmAb對照品的3次重復進樣，并持續給予加熱壓力而獲得。考慮到定量結果的嚴格性，計算的百分比豐度在CID和EAD方法中均具有高度的重現性（%CV<10%）。
圖3：SCIEX OS軟件的分析模塊對PQA的相對定量結果，圖標列出了以NISTmAb為對照，熱壓情況下三次進樣VVSV肽段的異構化和脫酰胺化峰面積的豐度百分比。
從0天到10天持續給與加熱壓力，脫酰胺化程度Asp和不同isoAsp形式的百分比值顯著增加。為了快速檢查結果，SCIEX OS軟件提供了用于可視化的度量圖（圖4A），或者可以使用其他繪圖選項在Excel中導出和處理結果（圖4B）。
圖4：MAM的可視化結果。圖（A）和圖（B）都展示了重復進樣的PQA量化的重現性，以及MAM工作流監測PQA豐度百分比的能力，以用于不同時間節點研究。
1.PQA的可靠識別及氨基酸異構體的明確區分對于MAM的成功實施至關重要。
2.通過基于EAD碎裂的DDA采集方法，可以區分脫酰胺作用中的Asp和isoAsp異構體，脫酰胺化是PQA的一個重要類別，可能影響藥物的療效和安全性。
3.通過現成的工作流程模板，Biologics Explorer軟件實現了高效識別，該模板提供了可靠的肽圖結果和可視化工具，能夠將PQA列表導出到SCIEX OS軟件進行量化。
4.符合法規要求的SCIEX OS軟件為PQA的峰提取和相對定量提供了強大的算法和工具。
5.通過Biologics Explorer軟件和合規的SCIEX OS軟件之間的數據流，實現了從識別到量化的有效MAM工作流。
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References
1. Takashi Baba, Pavel Ryumin, Eva Duchoslav et al. (2021) Dissociation of biomolecules by an intense low-energy electron beam in a high sensitivity time-of-flight mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 32(8):1964-1975.
2. Comprehensive peptide mapping of biopharmaceuticals utilizing electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12639-B.
3. A new electron activated dissociation (EAD) approach for comprehensive glycopeptide analysis of therapeutic proteins. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12980-A.
4. An evaluation of single injection platform method for advanced characterization of protein therapeutics using electron activation dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13965-A.
5. Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12550-B.
6. Differentiation of leucine and isoleucine using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12605-B.
7. Compliant attribute monitoring for biopharmaceutical product quality attributes employing intact mass analysis. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11314-A.
8. A liability study on oxidation using SCIEX OS software 1.7 for intact MAM. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11551-A.
多質量屬性監測MAM：
MAM是一種功能強大的LC-MS方法，用于同時監測和量化生物制品的多個產品質量屬性（PQA）或關鍵質量屬性（CQA）。傳統意義上，基于CID的MS/MS被用作鑒定的第一步，然后使用基于MS或MS和MS/MS工作流進行量化。然而，基于CID的MS/MS方法不可能對發生脫酰胺化的肽段進行全序列確認，包括區分亮氨酸與異亮氨酸、天冬氨酸與異天冬氨酸（Asp vs. isoAsp）以及脆弱修飾（如糖基化）的定位。因此，基于CID的鑒定工作流程必須依賴于互補的MS/MS技術，在對所選物種進行量化之前，在單獨的實驗中使用其他更先進的儀器。我們可以使用基于EAD的平臺方法5,6解決這一挑戰，該方法能夠在單針進樣中使用MAM對PQA進行可靠、準確的識別、量化和監測（圖1）。
圖1：基于EAD的MAM工作流程。ZenoTOF 7600系統提供的EAD平臺方法1-4為序列確認和翻譯后修飾（PTM）的識別提供了可靠的肽圖結果，并能夠區氨基酸分異構體。這是MAM獲得這些PQA和CQA準確量化結果的先決條件。用于肽圖分析的Biologics Explorer軟件和用于PQA和CQA量化的符合合規要求的SCIEX OS軟件的結合，使基于EAD的MAM工作流成為一個簡化的單針進樣過程。
基于EAD的MAM工作流的主要特點：
1 可靠的PQA識別和氨基酸異構體區分：單針進樣的EAD平臺方法可以區分氨基酸異構體和翻譯后修飾（PTM），這對傳統表征和MAM方法具有挑戰性。
2 簡化的數據流：可定制的PQA列表將Biologics Explorer軟件中的肽圖結果與符合合規性要求的SCIEX OS軟件將PQA量化和監測關聯起來。
3 強大的肽圖軟件：Biologics Explorer軟件為肽圖分析和PQA選擇提供了強大的算法和優化的工作流。
4 合規性：PQA量化和監控。
MAM流程概述：
圖2：Biologics Explorer軟件結合合規軟件SCIEX OS的MAM工作流。在此流程中，使用Biologics Explorer軟件從EAD DDA數據的肽圖中非常可信地確定了mAb的PQA。選擇感興趣的PQA并將其導出到.txt文件，然后導入到使用SCIEX OS軟件的分析模塊創建的處理方法中。峰面積積分使用MQ4算法執行，然后創建用于相對PQA量化和監測的自定義模板。報告功能提供了許多用于自定義和選擇不同文件格式的選項，例如word文檔和pdf文檔。
PQA的監控：
分析模塊提供了充分的靈活性，可以在處理方法中構建自定義公式，用于計算PQA的豐度百分比7-8。圖3顯示了VVSV肽段PQA的量化結果，該結果是通過將帶有自定義公式的處理方法應用于NISTmAb對照品的3次重復進樣，并持續給予加熱壓力而獲得。考慮到定量結果的嚴格性，計算的百分比豐度在CID和EAD方法中均具有高度的重現性（%CV<10%）。
圖3：SCIEX OS軟件的分析模塊對PQA的相對定量結果，圖標列出了以NISTmAb為對照，熱壓情況下三次進樣VVSV肽段的異構化和脫酰胺化峰面積的豐度百分比。
從0天到10天持續給與加熱壓力，脫酰胺化程度Asp和不同isoAsp形式的百分比值顯著增加。為了快速檢查結果，SCIEX OS軟件提供了用于可視化的度量圖（圖4A），或者可以使用其他繪圖選項在Excel中導出和處理結果（圖4B）。
總結：
1.PQA的可靠識別及氨基酸異構體的明確區分對于MAM的成功實施至關重要。
2.通過基于EAD碎裂的DDA采集方法，可以區分脫酰胺作用中的Asp和isoAsp異構體，脫酰胺化是PQA的一個重要類別，可能影響藥物的療效和安全性。
3.通過現成的工作流程模板，Biologics Explorer軟件實現了高效識別，該模板提供了可靠的肽圖結果和可視化工具，能夠將PQA列表導出到SCIEX OS軟件進行量化。
4.符合法規要求的SCIEX OS軟件為PQA的峰提取和相對定量提供了強大的算法和工具。
5.通過Biologics Explorer軟件和合規的SCIEX OS軟件之間的數據流，實現了從識別到量化的有效MAM工作流。
掃描二維碼查看相關資料
References
1. Takashi Baba, Pavel Ryumin, Eva Duchoslav et al. (2021) Dissociation of biomolecules by an intense low-energy electron beam in a high sensitivity time-of-flight mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 32(8):1964-1975.
2. Comprehensive peptide mapping of biopharmaceuticals utilizing electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12639-B.
3. A new electron activated dissociation (EAD) approach for comprehensive glycopeptide analysis of therapeutic proteins. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12980-A.
4. An evaluation of single injection platform method for advanced characterization of protein therapeutics using electron activation dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13965-A.
5. Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12550-B.
6. Differentiation of leucine and isoleucine using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12605-B.
7. Compliant attribute monitoring for biopharmaceutical product quality attributes employing intact mass analysis. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11314-A.
8. A liability study on oxidation using SCIEX OS software 1.7 for intact MAM. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11551-A.
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