FKM多光譜熒光動態顯微成像技術：藍藻異形胞光合特性研究
異形胞（heterocyst）某些絲狀藍藻（如束毛藻、魚腥藻、念珠藻等）所特有的變態營養細胞，是由普通營養細胞在一定的條件下尤其是氮素營養缺乏時分化而成。異形胞一般與營養細胞同形，單個地間生，一條藻絲上往往有數個異形細胞。異形胞與營養細胞的主要形態區別是：個體大，細胞壁厚，細胞質中的顆粒物質溶解成顆粒狀態，顏色呈淡黃綠色或呈透明狀。
而最為關鍵的生理功能區別有兩點：
1.異形胞能進行固氮作用，在其高含量固氮酶的催化下，將空氣中的N2轉變為NH3，NH4+，進而形成氨基酸。
2.異形胞藻膽素含量顯著低于營養細胞。
正是基于這兩點，則引出了科學家的兩點疑惑：
3.早期研究證實，藍藻在固氮過程中也是存在光合放氧的，但固氮酶會被氧氣不可逆地抑制。藍藻如何保護固氮酶不被光合作用放出的氧氣破壞？
4.如何直接觀測異形胞與營養細胞光合特性的差異？
從21世紀之初，隨著FKM多光譜熒光動態顯微成像技術的提出和逐漸完善，科學家對藍藻異形胞光合特性的研究達到前人所不能企及的高度，甚至取得了突破性的進展。本文通過相關文獻案例展示這一研究發展的過程：
1. 開端：證實固氮和光合作用的時空隔離
FKM多光譜熒光動態顯微成像技術于2000年正式提出并實用化，美國羅格斯大學Berman-Frank與德國康斯坦茨大學、捷克微生物研究所合作利用FKM技術對束毛藻Trichodesmium strain IMS101絲狀藻的光合特性進行研究，對比固氮酶的活性與分布，發現固氮和光合作用從時間和空間兩方面被隔離開了。他們推測在光合放氧進化的早期階段，固氮酶是厭氧異養機制的一個電子受體，而光系統I（PSI）為固氮提供了厭氧的微環境。這一研究成果發表于2001年《Science》。
之后，他們又合作進行更加深入的研究。通過FKM技術獲得的葉綠素熒光成像圖與熒光淬滅動力學曲線數據，再次表明束毛藻光合作用與固氮的協同作用涉及光合活性狀態可逆變化的復雜時空格局。 這些活性狀態提供了通過PSII的電子傳輸進行固氮所需的協調和微調，并將光合放氧對固氮酶的抑制作用降至最低。這一研究發表于2004年《Plant Physiology》。
在這一研究結果通過葉綠素熒光參數最小熒光F0、可變熒光Fv等，已經表明進行固氮的藍藻細胞其PSII活性已經極低，進而喪失光合放氧能力。研究者也推測固氮與光合的時空分隔可能與異形胞有關。但此時的FKM技術尚不完善，獲得的顯微熒光成像圖不能明確區分絲狀體上的單個細胞，因此也沒能獲得進一步的支持證據。
2. 進展：證實異形胞PSII功能特性
2007年，FKM技術迎來了一次全面升級。這次升級之后，FKM從原來主要測量微藻細胞，擴展到能夠測量植物葉片細胞，同時顯微放大倍數與成像分辨率進一步提升，能夠清晰分辨單個細胞乃至單個葉綠體。
于是，捷克科學院和南波西米亞大學、德國康斯坦茨大學再次合作，使用升級后的FKM系統對魚腥藻Anabaena sp. strain PCC 7120異形胞進行更深入研究。研究人員明確觀測到隨著氮素缺乏脅迫程度的加重，絲狀體細胞開始分化，營養細胞和異形胞的葉綠素參數F0、Fm、Fv等都逐漸下降，表明光合色素的下降。但這一過程中，營養細胞的最大光化學效率Fv/Fm和持續電子流（量子產額）ΦPSII基本穩定，表明其維持了PSII活性，但形成中的異形胞這兩項參數則顯著下降。更出人意料地，成熟的異形胞PSII天線色素含量顯著降低（F0顯著降低），但其PSII本身卻是完整的（Fv/Fm恢復）。至此，科學家終于直接觀測到異形胞PSII的分化過程與功能變化。
3. 突破：異形胞也能夠維持藻膽素含量
之前的研究表明，為了維持固氮這一高耗能過程，藍藻異形胞主要通過光系統I（PSI）合成ATP為其功能。藻膽素雖然是藻類光合最重要的光合色素之一，但由于其主要作為PSII的天線色素，而PSII光合過程中通過放氧復合體釋放的氧氣會使固氮酶失活。因此異形胞雖然具備完整的PSII，但其藻膽素含量顯著下降，從而吸收的光能很少進入PSII，使其失去光合放氧的能力，從而維持固氮酶活性。但這種機制的缺點是用于固氮的能量也由于藻膽素的缺失而受到限制。
美國華盛頓大學與PSI公司、中科院水生生物研究所合作，通過一種基因修飾系統對Anabaena 33047進行處理。通過MC1000八通道藻類培養監測系統模擬不同波長的高光培養環境，同步實時監測其OD730，表明這種藍藻可以在高光條件下具有良好的適應性。
未來，科學家還會運用FKM多光譜熒光動態顯微成像技術在異形胞、微藻細胞分化領域確定什么樣的突破呢？請拭目以待。如果您希望了解更多關于FKM多光譜熒光動態顯微成像技術的內容，請聯系我們，或訪問我們的官網搜索FKM：http://www.eco-tech.com.cn/
參考文獻：
1.Berman-Frank I, et al. 2001. Segregation of Nitrogen Fixation and Oxygenic Photosynthesis in the Marine Cyanobacterium Trichodesmium. Science, 294: 1534-1537
2.Küpper H, Ferimazova N, Šetlík I, et al. 2004. Traffic Lights in Trichodesmium. Regulation of Photosynthesis for Nitrogen Fixation Studied by Chlorophyll Fluorescence Kinetic Microscopy. Plant Physiology, 135: 2120-2133
3.Ferimazova N, et al 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91
4.Bandyopadhyay A, et al. 2021. Antenna Modification Leads to Enhanced Nitrogenase Activity in a High Light-Tolerant Cyanobacterium. mBio, 12(6): e03408-21
北京易科泰生態技術公司提供藻類培養與表型研究全面技術方案：
1.AquaPen、FluorCam藻類葉綠素熒光/多光譜熒光技術
2.SL3500、AlgaeTron/FytoScope智能LED光源與生長箱
3.SpectraPen/PolyPen、Specim高光譜測量技術
4.FKM多光譜熒光動態顯微成像系統
5.FMT150藻類培養與在線監測系統
6.MC1000 8通道藻類培養系統
7.ET-PSI多功能藻類培養與在線監測系統
8.AlgaTech®高通量藻類表型成像分析平臺
而最為關鍵的生理功能區別有兩點：
1.異形胞能進行固氮作用，在其高含量固氮酶的催化下，將空氣中的N2轉變為NH3，NH4+，進而形成氨基酸。
2.異形胞藻膽素含量顯著低于營養細胞。
正是基于這兩點，則引出了科學家的兩點疑惑：
3.早期研究證實，藍藻在固氮過程中也是存在光合放氧的，但固氮酶會被氧氣不可逆地抑制。藍藻如何保護固氮酶不被光合作用放出的氧氣破壞？
4.如何直接觀測異形胞與營養細胞光合特性的差異？
從21世紀之初，隨著FKM多光譜熒光動態顯微成像技術的提出和逐漸完善，科學家對藍藻異形胞光合特性的研究達到前人所不能企及的高度，甚至取得了突破性的進展。本文通過相關文獻案例展示這一研究發展的過程：
1. 開端：證實固氮和光合作用的時空隔離
FKM多光譜熒光動態顯微成像技術于2000年正式提出并實用化，美國羅格斯大學Berman-Frank與德國康斯坦茨大學、捷克微生物研究所合作利用FKM技術對束毛藻Trichodesmium strain IMS101絲狀藻的光合特性進行研究，對比固氮酶的活性與分布，發現固氮和光合作用從時間和空間兩方面被隔離開了。他們推測在光合放氧進化的早期階段，固氮酶是厭氧異養機制的一個電子受體，而光系統I（PSI）為固氮提供了厭氧的微環境。這一研究成果發表于2001年《Science》。
在這一研究結果通過葉綠素熒光參數最小熒光F0、可變熒光Fv等，已經表明進行固氮的藍藻細胞其PSII活性已經極低，進而喪失光合放氧能力。研究者也推測固氮與光合的時空分隔可能與異形胞有關。但此時的FKM技術尚不完善，獲得的顯微熒光成像圖不能明確區分絲狀體上的單個細胞，因此也沒能獲得進一步的支持證據。
2. 進展：證實異形胞PSII功能特性
2007年，FKM技術迎來了一次全面升級。這次升級之后，FKM從原來主要測量微藻細胞，擴展到能夠測量植物葉片細胞，同時顯微放大倍數與成像分辨率進一步提升，能夠清晰分辨單個細胞乃至單個葉綠體。
于是，捷克科學院和南波西米亞大學、德國康斯坦茨大學再次合作，使用升級后的FKM系統對魚腥藻Anabaena sp. strain PCC 7120異形胞進行更深入研究。研究人員明確觀測到隨著氮素缺乏脅迫程度的加重，絲狀體細胞開始分化，營養細胞和異形胞的葉綠素參數F0、Fm、Fv等都逐漸下降，表明光合色素的下降。但這一過程中，營養細胞的最大光化學效率Fv/Fm和持續電子流（量子產額）ΦPSII基本穩定，表明其維持了PSII活性，但形成中的異形胞這兩項參數則顯著下降。更出人意料地，成熟的異形胞PSII天線色素含量顯著降低（F0顯著降低），但其PSII本身卻是完整的（Fv/Fm恢復）。至此，科學家終于直接觀測到異形胞PSII的分化過程與功能變化。
3. 突破：異形胞也能夠維持藻膽素含量
之前的研究表明，為了維持固氮這一高耗能過程，藍藻異形胞主要通過光系統I（PSI）合成ATP為其功能。藻膽素雖然是藻類光合最重要的光合色素之一，但由于其主要作為PSII的天線色素，而PSII光合過程中通過放氧復合體釋放的氧氣會使固氮酶失活。因此異形胞雖然具備完整的PSII，但其藻膽素含量顯著下降，從而吸收的光能很少進入PSII，使其失去光合放氧的能力，從而維持固氮酶活性。但這種機制的缺點是用于固氮的能量也由于藻膽素的缺失而受到限制。
美國華盛頓大學與PSI公司、中科院水生生物研究所合作，通過一種基因修飾系統對Anabaena 33047進行處理。通過MC1000八通道藻類培養監測系統模擬不同波長的高光培養環境，同步實時監測其OD730，表明這種藍藻可以在高光條件下具有良好的適應性。
通過特殊定制的FKM系統，研究人員直接測量了營養細胞和異形胞的藻膽素熒光。結果表明， Anabaena 33047 ΔnblA突變株中異形胞的藻膽素熒光與營養細胞接近，但野生型異形胞則遠遠低于影響細胞。通過FKM熒光動態分析，ΔnblA突變株異形胞的藻膽素熒光是野生型異形胞的大約8倍高。這樣高含量的藻膽素，也就表明其可以為固氮過程提供遠高于野生型的ATP，顯著提高其固氮能力。這一最新研究成果發表于2021年《mBio》。
參考文獻：
1.Berman-Frank I, et al. 2001. Segregation of Nitrogen Fixation and Oxygenic Photosynthesis in the Marine Cyanobacterium Trichodesmium. Science, 294: 1534-1537
2.Küpper H, Ferimazova N, Šetlík I, et al. 2004. Traffic Lights in Trichodesmium. Regulation of Photosynthesis for Nitrogen Fixation Studied by Chlorophyll Fluorescence Kinetic Microscopy. Plant Physiology, 135: 2120-2133
3.Ferimazova N, et al 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91
4.Bandyopadhyay A, et al. 2021. Antenna Modification Leads to Enhanced Nitrogenase Activity in a High Light-Tolerant Cyanobacterium. mBio, 12(6): e03408-21
北京易科泰生態技術公司提供藻類培養與表型研究全面技術方案：
1.AquaPen、FluorCam藻類葉綠素熒光/多光譜熒光技術
2.SL3500、AlgaeTron/FytoScope智能LED光源與生長箱
3.SpectraPen/PolyPen、Specim高光譜測量技術
4.FKM多光譜熒光動態顯微成像系統
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