代謝組學助力探究3-苯乳酸對引起腐爛百合鱗莖的米根霉菌的抑制作用
文章標題：Energy metabolism as the target of3-phenyllactic acid against Rhizopus oryzae
發表期刊：InternationalJournal of Food Microbiology
發表期刊：InternationalJournal of Food Microbiology
影響因子：5.277
合作客戶：蘭州理工大學
百趣生物提供服務：TMT+中心碳
分組：2mg/mLPLA治療組、4mg/mLPLA治療組、8mg/mLPLA治療組和對照組(n=3)
研究背景
3-苯乳酸(PLA)具有廣泛的抗真菌活性，但對PLA在真菌細胞上的作用靶點及其作用機制的研究較少。本研究探討了3-苯乳酸對引起腐爛百合鱗莖的米根霉菌(R.oryzae)的抑制作用。PLA對米根霉菌的最低抑菌濃度為8mg/mL。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察米根霉菌的超微結構，結果表明PLA對米根霉菌的細胞膜沒有損傷，但對線粒體和其他細胞器有破壞作用。TMT蛋白組分析結果顯示PLA顯著下調己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、a-酮戊二酸脫氫酶(a-KGDH)、腺苷酸激酶(ADK1)、細胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase)和NADH脫氫酶(NADH dehydrogenase)的表達(P<0.05)。在糖酵解、三羧酸循環或氧化磷酸化代謝過程中，線粒體ADP/ATP載體蛋白(AAC)和亞基IV(CCIO IV)表達上調(P<0.05)。在此基礎上，通過酶活性檢測發現上述通路HK和a-KGDH活性下調，并通過實時熒光定量PCR進一步證實ADK1、AAC、CCIO IV和NADH脫氫酶基因表達下調。中心碳代謝組學研究表明，三羧酸循環代謝產物中檸檬酸、順-烏頭酸、異檸檬酸、-酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸和蘋果酸均顯著下調(P<0.05)，氧化磷酸化產生的ATP也顯著減少(P=0.02)。導致能源生產不足。因此，ROS水平升高了141%，細胞色素C被釋放，細胞逐漸凋亡。結果表明，能量代謝是PLA對米根霉的作用靶點。這一研究首次表明PLA對米根霉的能量代謝可能是其作用靶點，為進一步研究其抑菌機理提供了理論依據。
百趣代謝組學：機制探索不發愁，淺看真菌防治靶點代謝組學研究思路
研究結果
3-苯乳酸對米根霉生長的抑制作用
PLA處理組(2和4mg/mL)菌體的菌絲干重均低于對照組。當PLA濃度達到8 mg/mL時，隨著培養時間的延長，米根霉測得的干重基本沒有變化，說明在該濃度下米根霉的生長受到了嚴重的抑制。實驗結果表明，3-苯乳酸對米根霉的生長有較好的抑制作用，且隨著3-苯乳酸濃度的增加，對米根霉的抑制作用越明顯。
圖1. 米根霉的生長曲線(灰色線為對照組，紅色線為2mg/mLPLA治療組
3-苯乳酸對菌絲形態和超微結構的影響
用掃描電鏡(SEM)觀察了稻瘟菌的菌絲形態。對照樣品形態正常，菌絲飽滿，表面光滑(圖2.A1和A3)。PLA處理米根霉24h后，我們發現菌絲密集雜亂(圖2.A2和A4)，菌絲管腫脹起皺；但表面無明顯損傷或缺失(圖2.A4)。在菌絲表面觀察到一些分泌物(圓圈)，推測為胞外多糖(圖2.A4)。因此，推斷PLA處理對米根霉細胞壁沒有造成嚴重的破壞。
電鏡觀察顯示，對照組米根霉的超微結構完整，細胞壁正常光滑，細胞膜結構正常，胞漿壁無分離，線粒體形成相對規則(圖2.B1-B4)。經3-苯乳酸處理后,整個細胞結構萎縮，細胞外壁變薄，厚度不均勻。內側細胞膜呈齒狀凹陷，局部漿壁分離。細胞核消失，基質和內嵴不可見。細胞膜呈齒狀向內，漿壁部分分離(圖2.B4中紅色箭頭)。線粒體固縮，液泡塌陷。
綜上所述，PLA對米根霉線粒體及其他細胞器的破壞程度較高，這可能是PLA對米根霉抑制作用的靶點。
圖2.對照和PLA處理米根霉的SEM和TEM檢查:(A)SEM檢查，(B)TEM檢查
3-苯乳酸的蛋白表達對米根霉菌有抑制作用
利用TMT蛋白質組學方法，在PLA處理組和對照組之間發現了485個差異表達的蛋白。其中，PLA處理組有205個蛋白表達上調，280個蛋白表達下調。對差異表達蛋白進行COG分析(圖3)得知PLA可通過控制能量代謝影響米根霉菌的生長。且經PLA處理后的米根霉菌中HK、FK、SDH和a-KGDH的活性受到抑制。相比之下，PLA處理后的米根霉菌中PFK活性略有增加，碳流可能被轉移到其他丙酮酸分支點。這些結果與差異蛋白表達是一致的。
圖3. 差異表達蛋白的COG分析
圖4. 與糖酵解和TCA循環相關的關鍵酶活性，星號表示樣本間差異顯
表1. 4mg/mLPLA處理組與對照組在糖酵解、三羧酸循環或氧化磷酸化
米根霉菌中心碳代謝產物的差異及分析
通過中心碳檢測，我們在對照組和PLA處理組之間確定了51個中心碳代謝產物，其中22個代謝產物顯著上調，29個代謝產物顯著下調 (圖6)。利用KEGG數據庫對差異代謝產物的代謝途徑進行分析，差異表達的代謝產物在TCA循環、乙醛酸和二羧酸代謝、糖酵解或糖異生、丙酮酸代謝、光合生物碳固定和磷酸戊糖途徑中顯著富集。在本研究中， PLA處理顯著降低了米根霉菌中ADP和ATP的水平(表2)，說明PLA處理影響了米根霉菌的能量代謝。機體線粒體中的OXPHOS負責90%以上的細胞ATP的產生，結合蛋白質組學分析，這種效應可能是由于OXPHOS中一種或多種酶活性明顯缺乏，導致ATP合成減少。
表2. 4mg/mLPLA處理組與對照組在糖酵解、三羧酸循環或氧化磷酸化
圖6. 中心碳代謝產物在對照組和PLA處理組之間的差異
3-苯乳酸對細胞色素C釋放和ROS水平的影響
經過PLA處理的米根霉菌細胞質中的細胞色素C含量更高(圖7A)，這表明位于線粒體內外膜的細胞色素C缺失。在之前的一項研究中，反式肉桂醛處理導致細胞色素C滲漏并觸發線粒體介導的細胞凋亡。推斷PLA可能導致線粒體呼吸鏈功能障礙，進而導致ATP缺乏，導致細胞死亡。
當PLA處理米根霉菌，ROS水平增加，在4.0mg/LPLA時，ROS水平增加了141%(圖7B)。結果表明，PLA處理誘導水稻植株ROS積累，可能引起線粒體功能障礙和細胞氧化損傷。
在本研究中，我們發現PLA影響糖酵解、TCA循環和氧化磷酸化，導致能量生產不足和細胞凋亡。雖然目前還沒有關于對米根霉菌的抑制作用的研究，但與乳酸相比，PLA對其他真菌如黑曲霉具有顯著的抑制作用，與乙酸相比，PLA沒有明顯的刺激性氣味。此外，使用乳酸作為催化劑生產PLA可能是一種可行且環保的方法。因此，PLA可以作為一種很有前景的天然機制來控制食品中的污染物。
圖7. 對照組和PLA處理組之間的ROS水平和Cyt C釋放，星號表示樣本
結論
PLA對真菌細胞靶點的作用及其抗真菌機制研究較少。本研究通過生理生化、電鏡、TMT蛋白質組學和中心碳代謝組學等方法，探討了米根霉菌對百合腐爛球莖的抑制作用。首先，我們證明了PLA抑制了米根霉菌的生長，破壞了米根霉菌的形態和超微結構。其次，我們發現PLA處理降低了與糖酵解和TCA循環相關的關鍵酶的活性，導致丙酮酸和TCA循環產物的減少和能量的損失。最后，PLA處理通過影響電子傳遞鏈中的關鍵蛋白來影響氧化磷酸化，導致能量生產不足，且使米根霉菌的ROS水平升高，細胞色素C釋放，導致細胞凋亡逐漸發生。綜上所述，PLA通過能量代謝抑制米根霉菌的生長(圖8)。這是首次對PLA抑制真菌的機制進行全面研究。因此，PLA可作為一種有效的天然抗真菌藥物。
圖8. PLA抑制稻瘟病菌的可能機制是基于能量代謝，紫色代表減少
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