摘要

微波增強的多肽固相合成（SPPS）可以合成具有對稱賴氨酸分支的多抗原肽（MAPs）或多肽樹枝狀大分子，合成時間大幅降低，純度提高。四分支酰基載體蛋白（ACP）肽的合成在2小時內完成，純度為70%。四分支M10肽¹（巴西副球孢子菌糖蛋白T細胞表位）的合成在4小時內完成，純度為50%。在2小時內合成純度為80%的一個八聚體，第三代賴氨酸-亮氨酸抗菌肽樹枝狀大分子（G3KL）²。

引言

對稱分支肽（圖1）代表一類具有非常理想的理化和生物學特性的肽。在一些情況下，由于與蛋白質靶標的多價結合或具有更高的蛋白酶抗性，包含分支核心的肽，如多抗原肽（MAPs）或肽樹狀聚合物有更高的生物活性³。因此分支肽已被用于各種治療應用，包括開發抗微生物和抗病毒藥物^4,5、腫瘤靶向劑^6,7和藥物輸送載體⁸。

圖1:左：對稱分支的賴氨酸核心；

右：Fmoc-Lys(Fmoc)-OH

對稱分支肽的合成可通過在SPPS中使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH來生成支鏈位置。合成通常比較困難，因為在分支支架上肽鏈固有的緊密接近性，會導致空間沖突和肽偶聯不良。將微波能量應用于分支肽的合成克服了這些空間挑戰，允許更有效的偶聯和快速合成較少缺失的困難分支肽產物 (CarboMAXTM)。⁹

材料和方法

試劑

以下含有特定側鏈保護基團的Fmoc氨基酸購自CEM公司(Matthews, NC)：Arg(Pbf)、Asn (Trt)、Asp (OtBu)、Gln(Trt)、His (Boc)、Lys (Boc)、Tyr (tBu) 和Thr (tBu)。Rink Amide ProTide LL 樹脂也得自CEM 公司。Fmoc-6-Ahx-OH 購自AnaSpec (Fremont, CA)。Fmoc-Lys(Fmoc)OH 獲自 CreoSalus (Louisville, KY)。N,N'二異丙基碳二亞胺(DIC)、哌啶、三氟乙酸(TFA)、3,6-二氧六環-1,8-辛二硫醇(DODT) 和三異丙基硅烷(TIS) 購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水乙醚(Et2O)、乙酸、HPLC 級水和乙腈購自VWR (West Chester, PA)。LC-MS 級水(H2O) 和LC-MS 級 乙 腈 (MeCN) 購 自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成：四分支ACP, (VQAAIDYING)4-(K)2-K-Ahx-KK-NH2

使用CEM Liberty BlueTM 自動微波肽合成儀在Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.1 mmol 規模（樹脂規模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中進行脫保護。在 DMF (CarboMAX) ⁹中，五倍過量的Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進行偶聯反應。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用帶有 TFA/H2O/ TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系統進行切割。切割后，用無水乙醚沉淀肽并凍干過夜。

Tetra-branched ACP

多肽合成: 四分支M10, (LIAIHTLAIRYAN)4-(K)2-K-Ahx-KK- NH2

使 用 CEM Liberty BlueTM 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹 脂（離 子 交 換 容 量 ：0.19 meq/g）上 以 0.1 mmol 規模（樹脂規模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和 Oxyma Pure 在DMF 中進行脫保護。在 DMF 中 5 倍過量的Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進行偶聯反應( CarboMAX)⁹。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用帶有 TFA/H2O/TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系統進行切割。裂解后，用無水乙醚沉淀肽并過夜凍干。

Tetra-branched M10

多肽合成：G3KL 八聚體, (KL)8-(KKL)4-(KKL)2-KKL-Ah-KK-NH2

使 用 CEM Liberty Blue 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.25 mmol 規模（樹脂規模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中進行脫保護。在 DMF 中5倍過量的 Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進行偶聯反應(CarboMAX)⁹。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統進行切割。裂解后，用無水乙醚沉淀肽并凍干過夜。

G3KL Octamer

多肽分析

在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統上分析肽，該 檢 測 器 配 備 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7mm 和2.1×100mm）。UPLC 系統連接到Waters 3100 Single Quad MS 用于結構測定。在 Waters MassLynx 軟件上進行峰值分析。在 (i)H2O 和 (ii)MeCN 中以0.05% TFA的梯度洗脫進行分離。

結果

Liberty Blue 自動微波肽合成儀上的使用微波增強 SPPS 合成四分支的ACP多肽，產生了 70% 純度的目標肽（圖2）。

圖2：四分支ACP的UPLC色譜圖

Liberty Blue 自動微波肽合成儀上使用微波增強 SPPS 合成在Liberty Blue 自動微波肽合成儀上使用微波增強 SPPS 合成 G3KL 八聚體產生了 80% 純度的目標肽（圖4）。

圖3：四分支M10的UPLC色譜圖

圖4 ：G3KL八聚體的UPLC色譜圖

結論

與傳統的 SPPS 方法相比，使用微波增強的 SPPS 可以更快地制備對稱分支肽，并且純度更高。使用微波增強 SPPS，在2小時內合成了純度為 70% 的四分支 ACP。四支化 M10 肽的常規室溫合成需要超過42小時的手工勞動，目標肽的分離產率為 4%。

另一方面，微波增強的 SPPS 可在4小時內提供純度為50%。G3KL 八聚體的常規合成需要超過35小時的手工勞動時間，并以 8% 的分離產率產生目標肽。² 將微波能量應用于 G3KL 八聚體的合成可在2小時內以 80% 的純度提供目標肽 。

參考文獻

[1] Taborda, C. P.; Nakaie, C. R.; Cilli, E. M.; Rodrigues,E.G.;Silva, L. S.; Franco, M. F.; Travassos, L. R. Scand. J. Immunol. 2004, 59 (1), 58–65.

[2] Stach, M.; Siriwardena, T. N.; Köhler, T.; van Delden, C.; Darbre, T.; Reymond, J.-L. Angew. Chemie Int. Ed. 2014, 53 (47), 12827–12831.

[3] Falciani, C.; Lozzi, L.; Pini, A.; Corti, F.; Fabbrini, M.; Bernini, A.; Lelli, B.; Niccolai, N.; Bracci, L. Chem. Biol. Drug Des. 2007, 69 (3), 216–221.

[4] Liu, S. P.; Zhou, L.; Lakshminarayanan, R.; Beuerman, R. W. Int. J. Pept. Res. Ther. 2010, 16 (3), 199–213.

[5] Wynn, J. E.; Santos, W. L. Org. Biomol. Chem. 2015, 13 (21), 5848–5858.

[6] Falciani, C.; Pini, A.; Bracci, L. Expert Opin. Biol. Ther. 2009, 9 (2), 171–178.

[7] Minervini, A.; Siena, G.; Falciani, C.; Carini, M.; Bracci, L. Expert Rev. Anticancer Ther. 2012, 12 (6), 699–701.

[8] Brunetti, J.; Pillozzi, S.; Falciani, C.; Depau, L.; Tenori, E.; Scali, S.; Lozzi, L.; Pini, A.; Arcangeli, A.; Menichetti, S.; Bracci, L. Sci. Rep. 2015, 5, 17736.