模式生物-雞在基因編輯中的應用
除了吃以外，雞對脊椎動物的發育生物學、免疫學、生理學等研究領域也有不小的貢獻。
雞是第一個進行基因組測序的家禽，基因組大小為 1.06 G，是人類的三分之一，但與人類基因組的同源性高達 60%。這也是為什么禽流感會成為人獸共患病的原因。
雞胚的整個發育過程都在體外 (蛋殼中) 進行，可以直觀地觀察到每一個發育過程。因此，雞胚也一直被用作模式生物來研究發育中的胚胎。除此之外，雞蛋還可作為生物反應器，進行基因編輯后可以讓母雞產下的蛋中含有難以體外合成的藥用蛋白。
目前效率較高的雞基因編輯方法主要有兩種：PGC 編輯法和精子載體法。
PGC 編輯法
原始生殖細胞 (PGCs) 是高度特化的細胞，起源于外胚層，最初位于 X 期胚胎透明區的中心位置。在孵化至 3-4.5 天時，PGC 遷移到生殖脊，隨著性腺的發育，分化為雌性或雄性配子[1]。對 PGC 的編輯可從源頭改變基因型，因此，它成為制備基因編輯雞的理想選擇。將編輯后的 PGCs 后注入受體胚胎產生嵌合體，培育至性成熟后，嵌合體之間再交配，就有概率能夠從后代中獲得基因編輯后的純合體。Ioannidis 等人使用 PGC 編輯法在受精卵中敲除性別決定基因 DMRT1，獲得 DMRT1 缺失個體，雄性 DMRT1 缺失個體表現出雌性性狀，這直接證明了 DMRT1 劑量是鳥類的關鍵性別決定因素，對睪丸發育至關重要[2]。
圖 3. PGC 編輯法獲得 DMRT1 突變體的過程[2]
將雄性 PGCs 編輯后注射到雄性受精卵中，由此獲得缺失一個等位 DMRT1 的雄雞 (ZD+ZD-)，性成熟后與野生型母雞 (ZD+W) 交配，獲得具有四種基因型的子代：野生型雌雄雞 (ZD+ZD+、ZD+W) 和突變型雌雄雞 (ZD+ZD-、ZD-W)精子載體法
精子載體法是將精子在體外進行基因編輯后遞送到受體母雞中，從而產生基因敲除后的后代。這一方法彌補了 PGC 細胞難以體外培養的不足。Cooper 等人使用精子轉染輔助基因編輯的方法同樣將 DMRT1 用 CRISPR/Cas9 系統敲除，編輯效率為 0~26%[3]。
剛剛提到的 CRISPR/Cas9 是近幾年非常火爆的基因編輯技術。
CRISPR 系統最早是由日本研究者石野良純于 1987 年定義的。這個系統特異性地存在于大多數細菌和古生菌基因組中，能夠抵抗噬菌體對細菌的破壞，被認為是細菌的適應性免疫系統[4]。目前廣泛使用的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術是由細菌的適應性免疫機制類型 II 改造的。Jinek 等人通過融合 crRNA 和 tracrRNA 構造了一種更簡單的引導 RNA——sgRNA (single guide RNA)[5]，通常只有 20 nt。這一創新的出現簡化了 CRISPR/Cas9 技術的操作過程。sgRNA 能與靶序列互補配對，引導 Cas 蛋白對靶基因進行切割。因此，設計出一個特異性高的 sgRNA 是這項技術成功的關鍵因素之一。
圖 4. 細菌的三種適應性免疫機制[4]
我們一起來看看 CRISPR/Cas9 在雞上是如何應用的吧~在哺乳動物中已證明肌生成抑制素基因 (MSTN) 在哺乳動物的肌肉生長中發揮重要的作用，破壞該基因能增強骨骼肌的形成，可能有利于肌肉性狀的改良。Xu 等人利用 CRISPR/Cas9 系統在雛雞中敲除 MSTN 基因，與對照組相比，多數差異基因及 GO terms 與細胞增殖分化、肌肉生長發育、能量代謝等過程相關[6]。
禽流感病毒一直是危害人類健康及阻礙禽養殖業發展的敵人。研究表明，甲型流感病毒 (IAV) 能夠通過雞的 ANP32A 蛋白進行復制，用 CRISPR/Cas9 在雞胚成纖維細胞 (DF-1) 中編輯 ANP32 基因，使之缺乏完整的 ANP32A 后，感染病毒滴度與對照組相比顯著降低[7]。這為抗禽流感品種的培育提供了新思路。
基因編輯還能使雞成為生物反應器。Oishi 等人使用 CRISPR/Cas9 技術將 hIFN-β cDNA 引入 PGC，制備了基因編輯雞，成功使編輯母雞在其管狀腺體中表達 hIFN-β，并在蛋清中產下含有大量 hIFN-β 的雞蛋[8]。這一發現能為雞蛋在生物制藥生產中開辟新途徑。
a：野生型母雞 (WT) 產下的雞蛋；b：敲入 hIFN-β cDNA 的母雞 (KI) 產下的雞蛋，蛋清中有白色絮狀物 (white cloud, Wc)；c：通過 SDS-PAGE 評估 KI 和 WT 母雞蛋清中 hIFN-β 的產生。左 1 泳道為 WT 蛋清，左 2 泳道為 KI 蛋清白色絮狀物 (箭頭為 hIFN-β 條帶)，左 3 泳道為 KI 蛋清透明部分
然而，與哺乳動物相比，雞的受精卵結構和產卵過程較復雜 (雞蛋產出后就有已有 6 萬多個細胞)，無法獲得單個卵子，因此，基因編輯在雞上的應用與發展不那么一帆風順，目前依然存在編輯效率較低、純合體制備周期長等局限。
雞基因編輯之路，道阻且長，但是，編輯技術始終在發展中，相信在未來科研工作者們能夠突破這些壁壘。
參考文獻
1. B. C. Li, et al. Relationship between PGCs Settle and Gonad Development in the Early Chicken Embryo. Anim Biosci 2004;17(4):453-459.
2. Ioannidis J, et al. Primary sex determination in birds depends on DMRT1 dosage, but gonadal sex does not determine adult secondary sex characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Mar 9;118(10):e2020909118.
3. Cooper CA, et al. Generation of gene edited birds in one generation using sperm transfection assisted gene editing (STAGE). Transgenic Res. 2017 Jun;26(3):331-347.
4. Hsu PD, et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.
5. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.
6. Xu K, et al. Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle. Int J Mol Sci. 2020 Apr 8;21(7):2584.
7. Long JS, et al. Species specific differences in use of ANP32 proteins by influenza A virus. Elife. 2019 Jun 4;8:e45066.
8. Oishi I, et al. Efficient production of human interferon beta in the white of eggs from ovalbumin gene-targeted hens. Sci Rep. 2018 Jul 5;8(1):10203.
