大腸桿菌蛋白表達原理
 
1. 表達載體
 
小型環狀DNA可以自我復制。完整的質粒載體必須具有復制起點，啟動子，插入的目的基因，篩選標記和終止子。根據表達蛋白質的類型可分為單純表達載體和融合表達載體，前者是在目標蛋白的N端/C端添加特殊的序列，從而促進蛋白的可溶性和正確折疊，方便目的蛋白的快速親和純化，或者目標蛋白的表達定位。His和GST-是常使用的融合標簽。
 
2. 表達宿主菌
 
表達蛋白質的生物即為大腸桿菌。宿主細菌的選擇主要基于宿主細菌的特征和靶蛋白的特征。例如，靶蛋白需要形成二硫鍵。可以選擇Origami 2系列，Origami可以顯著增加在細胞質中形成二硫鍵的可能性，并提高蛋白質的溶解度和活性。
 
大腸桿菌表達系統種類
 
1. T7大腸桿菌表達
 
T7大腸桿菌表達表達目的基因的水平較高。但是如果目的基因對大腸桿菌有毒性，則會影響細胞的生長。T7大腸桿菌表達是用T7啟動子和T7 噬箘體轉錄體系的元件構建的表達系統。T7 RNA聚合酶是高活性RNA聚合酶，mRNA的合成速度是大腸桿菌中RNA聚合酶的五倍，并且某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶轉錄的序列也可以被轉錄，因此T7RNA聚合酶和T7噬箘體啟動子的存在的情況下，大腸桿菌本身的轉錄系統競爭不過T7噬箘體轉錄體系，最終受 T7噬箘體啟動子控制蛋白轉錄。
 
2. Lac和Tac大腸桿菌表達系統
 
Lac和Tac大腸桿菌表達系統是一種基于大腸桿菌紫膠操縱子調控機制設計和構建的表達系統。紫膠操縱子具有多順反子結構。在沒有誘導劑的情況下，負調控因子lacI基因產物與啟動子下游的操縱基因緊密結合，并開始組織轉錄。在誘導物IPTG的存在下，與阻遏物結合后，與操縱子結合的能力降低并解離，從而激活了lac操縱子的轉錄。用tac啟動子構建的表達系統稱為Tac表達系統。為了能夠嚴格調節Lac和Tac表達系統，將能夠產生過量lacI阻遏蛋白的lacI基因的突變型lacIq應用于表達系統。然而，當使用高拷貝復制子構建表達載體時，仍然觀察到更高水平的背景轉錄，并且將lacIq基因插入表達載體中以確保更多的lacI阻遏蛋白產生。
 
目前，許多商業表達載體是在Lac和Tac表達系統的基礎上改進和發展的。 Lac和Tac表達系統使用IPTG誘導轉錄，但是由于IPTG本身的毒性，從安全角度考慮，它不適合用于醫學目的表達和制備重組蛋白。一些國家還規范了供人類使用的重組蛋白的生產。 IPTG無法用于生產過程，因此認為阻遏蛋白lacI的溫度敏感突變體lacI（ts）可以應用于Lac和Tac表達系統。這些突變基因可以插入表達載體或整合到染色體中以實現lac。tac啟動子的轉錄受溫度嚴格調節，在較低溫度（30°C）下受到抑制，而在較高溫度（42°C）下開放。乳糖也可以代替IPTG誘導劑使用，但是其效率受多種因素的影響，并且受限制，因此乳糖導的有效劑量比IPTG高得多，乳糖本身可以被大腸桿菌作為碳源代謝。乳糖的存在還可以引起細菌的生理和生長特性的變化。
 
3. PL和PR大腸桿菌表達系統
 
以λ噬箘體早期轉錄啟動子PL、PR為核心構建的系統稱為PL和PR大腸桿菌表達系統。啟動子PL、PR具有很強的啟動轉錄能力，利用它們來構建表達載體在大腸桿菌表達系統發展初期就已被提出來并加以研究。這種表達系統基于溫度敏感突變體cl857的基因產物來調控PL、PR啟動子的轉錄，該基因產物在較低溫度（30℃）時以活性形式存在，在較高溫度（42℃）時失活。這種表達載體在普通大腸桿菌中相當不穩定，這是因為菌體中沒有cl基因產物，PL或PR啟動子的高強度直接轉錄所導致。解決這個問題的辦法之一是用溶源化λ噬箘體的大腸桿菌作為PL和PR啟動子表達載體的宿主菌；辦法之二是把cI857ts基因組裝在表達載體上，這樣就可以有更大的宿主菌選擇范圍。
 
由于PL和PR表達系統在誘導時不需要加入化學誘導劑，且成本低廉，因此起初幾個在大腸桿菌系統中制備的藥用重組蛋白質都采用這種表達系統。但是，它也有其本身的缺陷，首先是在熱刺激過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活，其中包括蛋白水解酶，因此有可能降解表達的重組蛋白。其次是大體積發酵培養菌體時，把培養溫度從30℃提高到42℃比較緩慢，這種的升溫方式可能影響誘導效果，影響重組蛋白的表達量。
 
義翹神州可提供大腸桿菌蛋白表達平臺！包括從密碼子優化到重組蛋白表達/純化的一站式服務，并且可提供內毒素去除等附加服務以滿足客戶的定制需求。實驗人員在可溶蛋白的表達純化及包涵體變復性方面具有豐富經驗，實驗室保存有多種常用載體和宿主菌，可滿足不同類型蛋白的重組表達，為客戶提供優質的重組蛋白。