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全基因組ChIP-seq分析揭示細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子PhoB的基因內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)

瀏覽次數(shù)：1014　發(fā)布日期：2023-5-30　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

細(xì)菌編碼許多轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子周圍的DNA結(jié)合并調(diào)控RNA聚合酶（RNAP）全酶以結(jié)合啟動(dòng)子DNA或異構(gòu)化為主動(dòng)轉(zhuǎn)錄構(gòu)象的能力來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始。目前對(duì)TF功能的研究幾乎集中在調(diào)節(jié)基因上游基因間區(qū)域的TF結(jié)合位點(diǎn)。然而，基因組規(guī)模分析鑒定出大量的TF結(jié)合位點(diǎn)位于基因內(nèi)（within genes），基因內(nèi)TF結(jié)合位點(diǎn)的比例在不同TF之間具有顯著差異。盡管基因內(nèi)存在大量TF結(jié)合位點(diǎn)，但對(duì)其功能知之甚少。

大腸桿菌（Escherichia coli）TF PhoB是一種保守的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控參與磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄。大部分PhoB結(jié)合位點(diǎn)位于基因內(nèi)，這些基因內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)與可檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)o關(guān)，且在進(jìn)化上不保守。許多基因內(nèi)PhoB位點(diǎn)位于H-NS結(jié)合區(qū)域，可能是由于PhoB和H-NS的共同序列偏好。

2023年04月17日，《mBio》雜志發(fā)表了題為“Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites”的研究論文，該研究通過(guò)對(duì)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子PhoB結(jié)合位點(diǎn)的ChIP-seq、RNA-seq整合分析，揭示了大腸桿菌PhoB的許多基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

標(biāo)題：Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites.（大腸桿菌PhoB調(diào)控元件的全基因組定位揭示了許多轉(zhuǎn)錄惰性的基因內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)）
時(shí)間：2023-04-17
期刊：mBio
影響因子：IF 7.786
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq、RT-qPCR等

研究摘要：
基因組規(guī)模分析揭示許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在基因內(nèi)部，引發(fā)了關(guān)于這些結(jié)合位點(diǎn)功能的問(wèn)題。最近研究揭示細(xì)菌基因內(nèi)的大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，但絕大多數(shù)結(jié)合位點(diǎn)的功能尚未研究。本研究繪制了轉(zhuǎn)錄因子PhoB在大腸桿菌基因組中的結(jié)合，揭示了大多數(shù)PhoB結(jié)合位點(diǎn)都位于基因內(nèi)。分析結(jié)果表明，基因內(nèi)PhoB結(jié)合位點(diǎn)與重疊基因調(diào)控?zé)o關(guān)。數(shù)據(jù)揭示了細(xì)菌可以耐受大量非調(diào)控性基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的存在，且這些結(jié)合位點(diǎn)不受選擇性壓力影響。

研究使用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）對(duì)pho調(diào)控元件進(jìn)行高分辨率的全基因組分析。研究對(duì)一組已知的pho調(diào)控基因進(jìn)行分析和擴(kuò)展，并鑒定出許多基因內(nèi)PhoB結(jié)合位點(diǎn)。分析結(jié)果顯示，絕大多數(shù)基因內(nèi)PhoB結(jié)合位點(diǎn)不保守，且與可檢測(cè)的調(diào)控功能無(wú)關(guān)。本研究數(shù)據(jù)表明，單個(gè)基因內(nèi)PhoB位點(diǎn)無(wú)功能，轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合許多基因內(nèi)位點(diǎn)，對(duì)局部轉(zhuǎn)錄（local transcription）幾乎沒(méi)有影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
（1）磷酸鹽限制條件下PhoB的全基因組結(jié)合

圖1：C末端帶有FLAG3標(biāo)簽的PhoB活性部分降低。qRT-PCR檢測(cè)在低磷酸鹽條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞中，野生型MG1655/pBAD24（wild type）、MG1655 ΔphoB（CDS091）/pBAD24（ΔphoB）和MG1655 phoB-FLAG3（DMF34）/pBAD24（phoB-FLAG3）中相對(duì)minD RNA對(duì)照的pstS RNA水平。值是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值；誤差線表示±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。

圖2：ChIP-seq鑒定PhoB結(jié)合位點(diǎn)。

ChIP-seq數(shù)據(jù)：（i）低磷酸鹽條件下的無(wú)標(biāo)簽對(duì)照，（ii）低磷酸鹽條件下的PhoB-FLAG3標(biāo)簽，（iii）高磷酸鹽條件下的PhoB-FLAG3標(biāo)簽。三個(gè)基因組區(qū)域，其中一個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。x軸表示基因組位點(diǎn)。y軸表示歸一化序列reads覆蓋范圍，正值表示序列reads比對(duì)到正義鏈，負(fù)值表示序列reads比對(duì)到反義鏈。
每個(gè)ChIP-seq peaks周圍100 bp區(qū)域顯著富集的DNA序列motif。
PhoB結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于ChIP-seq peaks中心區(qū)域位點(diǎn)分析。
ChIP-seq鑒定的PhoB結(jié)合位點(diǎn)的基因組背景餅圖。“基因內(nèi)和上游”位點(diǎn)是基因內(nèi)但注釋基因起始上游＜200bp位點(diǎn)。

表1：ChIP-seq鑒定的PhoB結(jié)合區(qū)域列表

圖3：ChIP-seq和ChIP-ChIP數(shù)據(jù)集比較分析

本研究ChIP-seq數(shù)據(jù)和已發(fā)表的ChIP-ChIP數(shù)據(jù)集之間的共有區(qū)域中，每個(gè)ChIP-seq peaks周圍100 bp區(qū)域顯著富集的DNA序列motif。
本研究ChIP-seq數(shù)據(jù)的特異性區(qū)域，每個(gè)ChIP-seq peaks周圍100 bp區(qū)域顯著富集的DNA序列motif。

（2）pho調(diào)控元件的再評(píng)估

圖4：大腸桿菌野生型和ΔphoB菌株的RNA-seq分析。散點(diǎn)圖顯示野生型（MG1655/pBAD24）或ΔphoB（CDS091/pBAD24）細(xì)胞中所有基因的相對(duì)RNA水平。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)基因，三角形數(shù)據(jù)點(diǎn)代表先前報(bào)道的pho調(diào)控元件中的基因，紅色三角形表示該轉(zhuǎn)錄本ChIP-seq鑒定的上游PhoB位點(diǎn)，灰色三角形表示沒(méi)有上游位點(diǎn)。紅色圓圈表示以前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的基因位于pho調(diào)控元件中，但在ChIP-seq中鑒定出上游PhoB位點(diǎn)。藍(lán)色圓圈表示ChIP-seq鑒定出的內(nèi)部PhoB位點(diǎn)基因。灰色圓圈表示所有其他基因。

圖5：pho調(diào)控元件潛在成員基因中RNAP（β亞基）占有率差異。
野生型MG1655（深色條）和MG1655 ΔphoB（CDS091；淺色條）中，ChIP-qPCR檢測(cè)的RNAP（β亞基）占有率是pho調(diào)控元件潛在成員的基因內(nèi)區(qū)域。左側(cè)示意圖顯示上游或內(nèi)部PhoB位點(diǎn)的基因（紅色垂直線）。水平條表示ChIP-qPCR中PCR擴(kuò)增子位點(diǎn)，黑色條表示PhoB位點(diǎn)上游基因內(nèi)的擴(kuò)增子，綠色條表示基因內(nèi)PhoB位點(diǎn)上游的擴(kuò)增子，藍(lán)色條表示基因內(nèi)PhoB位點(diǎn)下游的擴(kuò)增子。

（3）起始RNAP的PhoB依賴性招募

圖6：野生型和ΔPhoB細(xì)胞PhoB結(jié)合位點(diǎn)周圍σ⁷⁰占有率差異。
散點(diǎn)圖顯示ChIP-seq鑒定的phoB結(jié)合位點(diǎn)周圍400bp區(qū)域在野生型MG1655和MG1655 ΔphoB（DMF84）中的歸一化σ⁷⁰占有率。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)PhoB結(jié)合位點(diǎn)。基因間結(jié)合位點(diǎn)由紅色數(shù)據(jù)點(diǎn)表示，基因內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)由藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn)表示。與PhoB結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的基因在野生型和ΔPhoB細(xì)胞的σ⁷⁰占有率相差>2倍。

（4）H-NS與許多基因內(nèi)PhoB位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，但不阻斷RNAP招募

圖7：H-NS抑制許多啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄

通過(guò)ChIP-seq鑒定的野生型MG1655和MG1655 Δhns（AMD565a）PhoB結(jié)合位點(diǎn)周圍400 bp區(qū)域的歸一化σ⁷⁰占有率散點(diǎn)圖。
通過(guò)ChIP-seq檢測(cè)MG1655Δhns（AMD565a）細(xì)胞中所有σ⁷⁰結(jié)合位點(diǎn)，鑒定出野生型MG1655和MG1655 Δhns（AMD565a）的歸一化化σ⁷⁰占有率散點(diǎn)圖。

圖8：H-NS不抑制PhoB依賴性起始RNA聚合酶招募效應(yīng)

（5）PhoB結(jié)合位點(diǎn)的序列保守性

圖9：PhoB結(jié)合位點(diǎn)在γ -變形菌屬（Gammaproteobacteria）物種中的保守性

參考文獻(xiàn)：
Fitzgerald DM, Stringer AM, Smith C, Lapierre P, Wade JT. Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites. mBio. 2023 Apr 17:e0253522.

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標(biāo)簽： ChIP-seq RNA-seq

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