昆蟲表達服務實驗流程介紹
一、 昆蟲表達系統概述
昆蟲表達體系是四大蛋白表達系統（原核細胞，酵母，昆蟲細胞，真核哺乳動物表達體系）之一。昆蟲表達系統的原理是通過將轉移載體中的表達組件轉座到大腸桿菌中增殖的桿狀病毒穿梭載體上，提取穿梭質粒DNA轉染昆蟲細胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清侵染昆蟲細胞，獲得表達的重組蛋白。
二、 昆蟲表達系統實驗流程
1. 把目的基因克隆至pFastBac系列載體產生重組質粒
根據pFastBac系列載體的多克隆位點選擇合適的酶切位點，按照讀碼框插入目的基因序列。通過測序驗證插入序列是否正確。
2. 轉化DH10Bac大腸桿菌
轉化pFastBac重組質粒到DH10 Bac大腸桿菌中，37℃培養48小時。可以選擇pFastBac1-EGFP作為對照質粒。轉化后利用藍白斑篩選重組菌株。重組菌株由于轉座會導致LacZ基因的破壞而呈現白斑，用于藍白斑篩選的LB瓊脂糖平板應含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素，10 μg/ml四環素，40 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG。
3. 陽性驗證（選做）
挑取白斑，重新劃線以確認獲得的白色克隆是真實的白斑。平板含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素，10 μg/ml四環素，40 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG，37℃培養過夜。
挑取白斑，培養過夜。須使用含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素和10 μg/ml四環素的LB培養液。
5. 重組bacmid質粒提取
小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA。重組bacmid DNA應該分裝凍存于-20℃，因為反復凍融會導致bacmid斷裂等從而顯著降低其轉化效率。如兩星期內使用，可保存于4℃。
6. 重組bacmid的PCR鑒定
利用 PCR反應對陽性克隆進行進一步的驗證。PCR 反應所用引物為pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。沒有發生轉座的bacmid其所擴增所產生的片段長度為350bp，重組bacmid擴增所產生的片段的長度為350bp加上插入片段的長度。
7. 重組bacmid轉染昆蟲細胞
將提取的重組Bacmid轉染進入昆蟲細胞，轉染后，28℃培養24小時，細胞和細胞核開始變大；轉染后24-72小時，細胞慢慢停止生長、脫落，細胞表面長出芽孢狀結構；轉染后72小時候細胞開始裂解，此時病毒開始釋放到培養液中。如果同時轉染了pFastBac1-EGFP，在轉染72小時后可以觀察到大部分細胞呈現綠色熒光，轉染后96小時幾乎所有的細胞都呈現綠色熒光，這樣可以作為整個病毒包裝體系的陽性對照。
8. 收集P1代桿狀病毒
轉染96小時后，收集培養液上清，500g離心5分鐘以沉淀細胞和細胞碎片，取上清即為P1代桿狀病毒。此時病毒滴度通常為1X106-1X107 pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分裝于含2% FBS的培養液中后在-80℃較長期保存。反復凍融會大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
9. P1代桿狀病毒的擴增
P1代病毒再次感染昆蟲細胞可獲得P2代病毒。如果采用懸浮培養的昆蟲細胞進行病毒擴增，建議使用10 ml培養液并且控制細胞密度為2X106/ml；如果使用6孔板貼壁培養的細胞進行擴增，細胞密度應為2X106/well，MOI (multiplicity of infection)為0.05-0.1（即每100個細胞用5-10 pfu的病毒進行感染）。28℃培養48-72小時后，70-80%的細胞死亡時，收集細胞和上清，500g離心5分鐘，取上清即為P2代病毒。此時病毒滴度約為1X107-1X108 pfu/ml。可收集本步驟離心后的細胞碎片沉淀，加入適量的1X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，裂解后進行SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot檢測，以分析確定目的蛋白是否已經正常表達。
10. 病毒感染昆蟲細胞進行目的蛋白的大規模表達
可選擇Sf9/Sf1/HighFive的任何一種細胞株進行蛋白大規模表達。但如果表達的是分泌蛋白，建議選用HighFive。建議在昆蟲細胞的對數生長期進行病毒感染，此時細胞密度在1X106/ml-2X106/ml為佳，MOI可從5-10開始嘗試。建議在不同的時間階段，如感染后24、48、72或96小時收集細胞，裂解細胞，SDS-PAGE并進行Western Blot檢測以確定最佳的停止蛋白表達的時間。因為昆蟲細胞內有很多蛋白酶，表達時間過長會導致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表達高峰通常在感染后30-72小時，而非分泌蛋白的表達高峰通常在感染后48-96小時。
11. 目的蛋白的純化
利用pFastBac1進行目的蛋白的表達的時候，根據蛋白純化方式的需要以及融合表達目的蛋白以提高其表達量的需要，可以在質粒構建時添加His標簽或GST標簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標簽影響目的蛋白的生物學功能和結構研究，可在融合蛋白和標簽之間添加蛋白酶酶切位點，如TEV或PreScission的酶切位點。如果蛋白主要以可溶形式表達，離心收集昆蟲細胞，超聲裂解細胞，但由于昆蟲細胞內蛋白酶種類比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。同時可以利用離子交換、分子篩層析等進一步純化目的蛋白。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當濃縮后保存等。
三、昆蟲表達系統的優缺點
優點：
1. 外源基因表達水平高、易于表達異源多聚體蛋白、安全性高。
2. 重組表達的蛋白產品具有正確的翻譯后修飾和生物學活性，如二硫鍵的形成、磷酸化、糖基化等等。
3. 相對于哺乳動物細胞蛋白表達系統，蛋白昆蟲表達體系所生產的蛋白，糖基化程度偏低。但是昆蟲蛋白表達系統的優勢在于，利用病毒進行轉染，操作相對容易，轉染體系容易形成（相對哺乳動物瞬時轉染體系）。
4. 可容納大分子的插入片段。
5. 昆蟲細胞懸浮生長，容易放大培養，有利于大規模表達重組蛋白。
6. 易于表達異源多聚體蛋白，可通過多種重組病毒同時感染昆蟲細胞或用含有多個表達框的一種病毒感染昆蟲細胞來實現
缺點：
外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的調控之下，這時由于病毒感染，細胞開始死亡。
四、昆蟲表達系統的應用
1．作為超高效的真核基因表達載體，生產有用的工程蛋白
2．作為基因工程病毒殺蟲劑，提高害蟲防治效率
3．研究桿狀病毒基因組的結構與功能
4．研究真核基因表達的調控機制
昆蟲表達體系是四大蛋白表達系統（原核細胞，酵母，昆蟲細胞，真核哺乳動物表達體系）之一。昆蟲表達系統的原理是通過將轉移載體中的表達組件轉座到大腸桿菌中增殖的桿狀病毒穿梭載體上，提取穿梭質粒DNA轉染昆蟲細胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清侵染昆蟲細胞，獲得表達的重組蛋白。
二、 昆蟲表達系統實驗流程
1. 把目的基因克隆至pFastBac系列載體產生重組質粒
根據pFastBac系列載體的多克隆位點選擇合適的酶切位點，按照讀碼框插入目的基因序列。通過測序驗證插入序列是否正確。
2. 轉化DH10Bac大腸桿菌
轉化pFastBac重組質粒到DH10 Bac大腸桿菌中，37℃培養48小時。可以選擇pFastBac1-EGFP作為對照質粒。轉化后利用藍白斑篩選重組菌株。重組菌株由于轉座會導致LacZ基因的破壞而呈現白斑，用于藍白斑篩選的LB瓊脂糖平板應含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素，10 μg/ml四環素，40 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG。
3. 陽性驗證（選做）
挑取白斑，重新劃線以確認獲得的白色克隆是真實的白斑。平板含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素，10 μg/ml四環素，40 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG，37℃培養過夜。
挑取白斑，培養過夜。須使用含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素和10 μg/ml四環素的LB培養液。
5. 重組bacmid質粒提取
小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA。重組bacmid DNA應該分裝凍存于-20℃，因為反復凍融會導致bacmid斷裂等從而顯著降低其轉化效率。如兩星期內使用，可保存于4℃。
6. 重組bacmid的PCR鑒定
利用 PCR反應對陽性克隆進行進一步的驗證。PCR 反應所用引物為pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。沒有發生轉座的bacmid其所擴增所產生的片段長度為350bp，重組bacmid擴增所產生的片段的長度為350bp加上插入片段的長度。
7. 重組bacmid轉染昆蟲細胞
將提取的重組Bacmid轉染進入昆蟲細胞，轉染后，28℃培養24小時，細胞和細胞核開始變大；轉染后24-72小時，細胞慢慢停止生長、脫落，細胞表面長出芽孢狀結構；轉染后72小時候細胞開始裂解，此時病毒開始釋放到培養液中。如果同時轉染了pFastBac1-EGFP，在轉染72小時后可以觀察到大部分細胞呈現綠色熒光，轉染后96小時幾乎所有的細胞都呈現綠色熒光，這樣可以作為整個病毒包裝體系的陽性對照。
8. 收集P1代桿狀病毒
轉染96小時后，收集培養液上清，500g離心5分鐘以沉淀細胞和細胞碎片，取上清即為P1代桿狀病毒。此時病毒滴度通常為1X106-1X107 pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分裝于含2% FBS的培養液中后在-80℃較長期保存。反復凍融會大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
9. P1代桿狀病毒的擴增
P1代病毒再次感染昆蟲細胞可獲得P2代病毒。如果采用懸浮培養的昆蟲細胞進行病毒擴增，建議使用10 ml培養液并且控制細胞密度為2X106/ml；如果使用6孔板貼壁培養的細胞進行擴增，細胞密度應為2X106/well，MOI (multiplicity of infection)為0.05-0.1（即每100個細胞用5-10 pfu的病毒進行感染）。28℃培養48-72小時后，70-80%的細胞死亡時，收集細胞和上清，500g離心5分鐘，取上清即為P2代病毒。此時病毒滴度約為1X107-1X108 pfu/ml。可收集本步驟離心后的細胞碎片沉淀，加入適量的1X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，裂解后進行SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot檢測，以分析確定目的蛋白是否已經正常表達。
10. 病毒感染昆蟲細胞進行目的蛋白的大規模表達
可選擇Sf9/Sf1/HighFive的任何一種細胞株進行蛋白大規模表達。但如果表達的是分泌蛋白，建議選用HighFive。建議在昆蟲細胞的對數生長期進行病毒感染，此時細胞密度在1X106/ml-2X106/ml為佳，MOI可從5-10開始嘗試。建議在不同的時間階段，如感染后24、48、72或96小時收集細胞，裂解細胞，SDS-PAGE并進行Western Blot檢測以確定最佳的停止蛋白表達的時間。因為昆蟲細胞內有很多蛋白酶，表達時間過長會導致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表達高峰通常在感染后30-72小時，而非分泌蛋白的表達高峰通常在感染后48-96小時。
11. 目的蛋白的純化
利用pFastBac1進行目的蛋白的表達的時候，根據蛋白純化方式的需要以及融合表達目的蛋白以提高其表達量的需要，可以在質粒構建時添加His標簽或GST標簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標簽影響目的蛋白的生物學功能和結構研究，可在融合蛋白和標簽之間添加蛋白酶酶切位點，如TEV或PreScission的酶切位點。如果蛋白主要以可溶形式表達，離心收集昆蟲細胞，超聲裂解細胞，但由于昆蟲細胞內蛋白酶種類比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。同時可以利用離子交換、分子篩層析等進一步純化目的蛋白。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當濃縮后保存等。
圖1 昆蟲表達系統實驗流程
三、昆蟲表達系統的優缺點
優點：
1. 外源基因表達水平高、易于表達異源多聚體蛋白、安全性高。
2. 重組表達的蛋白產品具有正確的翻譯后修飾和生物學活性，如二硫鍵的形成、磷酸化、糖基化等等。
3. 相對于哺乳動物細胞蛋白表達系統，蛋白昆蟲表達體系所生產的蛋白，糖基化程度偏低。但是昆蟲蛋白表達系統的優勢在于，利用病毒進行轉染，操作相對容易，轉染體系容易形成（相對哺乳動物瞬時轉染體系）。
4. 可容納大分子的插入片段。
5. 昆蟲細胞懸浮生長，容易放大培養，有利于大規模表達重組蛋白。
6. 易于表達異源多聚體蛋白，可通過多種重組病毒同時感染昆蟲細胞或用含有多個表達框的一種病毒感染昆蟲細胞來實現
缺點：
外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的調控之下，這時由于病毒感染，細胞開始死亡。
四、昆蟲表達系統的應用
1．作為超高效的真核基因表達載體，生產有用的工程蛋白
2．作為基因工程病毒殺蟲劑，提高害蟲防治效率
3．研究桿狀病毒基因組的結構與功能
4．研究真核基因表達的調控機制
標簽：
卡梅德 昆蟲表達系統
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