ChIP-seq等在揭示Runx2通過轉錄調控表達激活肝星狀細胞中的應用
肌成纖維細胞（myofibroblasts）主要由肝臟中活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells HSC)組成，在肝纖維化進展中發揮著核心作用。由于肌成纖維細胞主要負責細胞外基質蛋白的合成、沉積和重塑，因此靶向HSC被認為是肝纖維化治療的一種新策略，并且正在進行越來越多的臨床前研究和臨床試驗。先前的研究表明，runt相關轉錄因子2 (Runx2)與非酒精性脂肪性肝病的發生發展相關，但其在肝星狀細胞活化和肝纖維化中的具體作用尚不清楚。
2023年7月5日，重慶醫科大學附屬第一醫院鄧亮博士團隊在《Clin Transl Med》雜志發表題為“Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression”的研究論文，該研究以人和小鼠的肝星狀細胞(hepatic stellate cells HSC)為研究對象，通過RNA-seq和ChIP-seq等分析揭示Runx2在肝纖維化過程中通過轉錄調控Itgav（(integrin alpha-V)表達對HSC活化至關重要，提示Runx2可能是肝纖維化的一個潛在治療靶點。
標題：Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression（Runx2通過轉錄調控Itgav表達活化肝星狀細胞以促進肝纖維化）
時間：2023-07-05
期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：IF 10.6
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
研究摘要：
本研究分析結果表明，Runx2表達在不同病因的人肝纖維化中顯著上調；在小鼠肝纖維化過程中，Runx2表達也逐漸上調，且Runx2主要在活化的HSC中表達。HSC中Runx2敲除可以顯著減少由CCl4誘導、由1,4-二氫-2, 3,5-吡啶二甲酸二乙酯（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine）（DDC）誘導、由蛋氨酸膽堿缺乏癥（MCD）誘導的肝纖維化，而肝通過注射HBAAV-Runx2或VA-Lip-Runx2的Runx2過表達加劇了CCl4誘導的肝纖維化。體外實驗分析表明，Runx2促進HSC的活化和增殖，而在HSC中Runx2的敲除則抑制了這些作用。RNA-seq和Runx2的ChIP-seq分析表明，Runx2可以通過與其啟動子結合以促進整合素α - v (integrin alpha-V，Itgav)表達。阻斷Itgav表達可減少Runx2誘導的HSC活化和肝纖維化。此外研究還揭示了細胞因子（TGF-β1、PDGF、EGF）通過蛋白激酶A（PKA）促進HSC中Runx2表達和核轉位(nuclear translocation)。
Runx2促進HSC活化和肝纖維化過程的示意圖
研究結果
（1）Runx2表達在肝纖維化過程中逐漸上調
圖1：Runx2表達在肝纖維化發展過程中逐漸上調。
（A） 與對照樣本相比，Runx2在GSE25097隊列的人肝硬化組織（左）、GSE103580隊列的酒精性肝炎或肝硬化的人肝臟組織（中）以及GSE49541隊列的不同纖維化階段（FS）的人肝纖維化組織（右）中的mRNA表達。
（B-C） Western blot分析和qRT-PCR檢測人非纖維化或肝硬化肝樣品中Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（D） 從非纖維化或肝硬化患者采集人肝臟組織樣本。對各組肝臟組織中代表性的Masson組織學、α-SMA和Runx2的IHC染色分析。ImageJ軟件定量檢測陽性染色區域。比例尺：50μm（n=10）。
（E） 與對照樣品相比，Runx2在GSE31431小鼠肝纖維化組織中的mRNA表達。
（F-G）腹腔注射CCl4（5μL/G體重）誘導小鼠肝纖維化4周。Western blot和qRT-PCR分析肝臟組織Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（H） 小鼠被喂食高脂肪飲食12個月以誘導NASH相關纖維化。IP注射CCl4誘導小鼠肝纖維化4周。對各組肝臟組織中代表性Masson組織學、α-SMA和Runx2的IHC染色。ImageJ軟件定量測量陽性染色區域。比例尺：50μm（n=6）。數據為平均值±SEM，*p、**p<0.05與對照組比較#p＜0.01；ns，不顯著。
（2）Runx2特異性位于體內活化的HSC中，并在體外HSC活化過程中以時間依賴性方式增加
（B） 以olive或CCl4處理小鼠4周后，分離出原代HSC，然后RNA-seq分析檢測沉默HSC（qHSC，olive）和活化HSC（aHSC，CCl4），并進行火山圖分析。
（C） 小提琴圖顯示了每個聚類所選標記基因（Runx2、α-SMA和Col1a1）的相對表達；平均每個條件1000個細胞。
（D-E）從正常小鼠肝臟中分離原代HSC，并在指定時間間隔（第1、4和7天）培養。Western blot和qRT-PCR檢測Runx2、α-SMA、I型膠原（collagen I）和TGF-β1的蛋白和mRNA表達（n=5）。
（F） Runx2和α-SMA在指定時間間隔培養的原代HSC中的免疫熒光染色。顯示高倍圖像（n=3）。數據為平均值±SEM，與對照組相比*p＜0.05。
（3）HSC特異性敲除Runx2可以減少CCl4誘導、DDC誘導或MCD誘導的小鼠肝纖維化
（B-C）用olive或CCl4處理HSC小鼠4周，利用Western blot和qRT-PCR分析Runx2、I型膠原和α-SMA在Runx2f+ 和Runx2△+HSC中的蛋白質和mRNA水平（n＝3）。
（D） 用olive或CCl4處理的Runx2f+和Runx2小鼠肝臟組織中I型膠原和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）。
（E） Runx2f+和Runx2△+HSC小鼠用0.1%的DDC喂養4周以誘導膽汁淤滯，或用MCD喂養8周以誘導NASH。顯示了a-SMA的H&E、Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=3）。
（4）Runx2過表達加劇了CCl4誘導的肝纖維化
圖4：Runx2過表達加劇了CCl4誘導的肝纖維化
（A） Runx2在肝纖維化中過表達的實驗設計示意圖。小鼠在通過HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2（100μL/只，1×1012 V g/mL，門靜脈）注射3周后，連續4周注射olive或CCl4。
（B-C）Western blot和qRT-PCR檢測Runx2、I型膠原和α-SMA的蛋白和mRNA表達（n=3）。
（D） 經olive或CCl4處理的HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中膠原I和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性圖像。比例尺：100μm（n=5）。
（5）Runx2在體外調控HSC活化
（B） 從Runx2△/△HSC或HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC，并在3%FBS條件下培養4天。
（C） 從Runx2f/f 或 Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過qRT-PCR測定纖維相關基因。
（D） Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1在Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC中的Western blot分析。
（E-F）通過qRT-PCR和Western blot分析從HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中分離的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1的mRNA和蛋白表達。
（G-H）通過流式細胞術分析原代HSC中各個細胞周期階段的指數生長百分比。
（I） 從Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過免疫熒光染色檢測α-SMA活化特征（n＝3）。
（6）Itgav是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點
圖6：Itgav(integrin alpha-V)是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點
（A） 對用Runx2或Scramble siRNA轉染并培養3天的原代HSC進行RNA-seq分析，并對差異表達基因（DEG）進行KEGG通路富集分析。
（B） 對從HBAAV-Runx2小鼠分離的原代HSC進行Runx2 ChIP-seq分析，并對DEG進行KEGG通路富集分析。
（C） 通過ChIP-seq分析，對348個啟動子與Runx2結合基因和183個TGF-β通路相關基因進行交叉分析。
（D） 基因組圖譜顯示Itgav轉錄啟動子區的Runx2結合位點（Chr2:8372357-83723806）。
（E） 經pCDNA 3.1-ctrl或pCDNA 3.1-Runx2轉染的小鼠HSC細胞系上進行熒光素酶報告基因分析。
（F-G） 經CCl4處理4周的Runx2f/+、Runx2△/+HSC、HBAAV-ctrl和HBAAV-Runx2小鼠中采集肝臟組織。通過qRT-PCR和Western blot分析Itgav的mRNA和蛋白表達。
（H-I） 分別從Runx2f/f小鼠、Runx2△/△HSC小鼠、HBAAV-ctrl小鼠和HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC。用qRT-PCR分析Itgav的mRNA表達。Western blot分析Itgav及其下游激酶（FAK、pFAK、PI3K、pPI3K，Smad2/3和pSmad2/3）的蛋白表達。數據為平均值±SEM；n＝3， *p＜0.05，#p＜0.05。
（7）αv整合素抑制劑阻斷Runx2過表達引起的CCl4誘導肝纖維化加劇
（B-C）Western blot和qRT-PCR分析原發性HSC中α-SMA的蛋白質和mRNA表達水平（n=3）。
（D） CWHM-12體內實驗的靶向處理方案。小鼠服用CCl4 2周，然后插入含有CWHM-12（100mg/kg/天）或安慰劑（載體）的Alzet微型泵，隨后再服用2周CCl4。
（E-F）qRT-PCR和Westernblot分析檢測用或不用CWHM-12處理的HBAAV-Runx2或HBAAV-ctrl小鼠的肝臟組織中α-SMA的mRNA和蛋白表達（n=3）。
（G） I型膠原和α-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）
（8）PKA調控HSC中Runx2的活化和核轉位（nuclear translocation）
（B） 經或不經TGF-β1，然后用PKA活化劑（8-Bromo-cAMP，0.5 nM/mL）或抑制劑（n=3）處理的原代HSC中細胞質和細胞核內Runx2的Western blot分析。
（C） PKA抑制劑或活化劑處理的原代HSC中Runx2和α-SMA的免疫熒光染色（n=3）。
參考文獻：
Zhong L, Zhao J, Huang L, Liu Y, Pang X, Zhan K, Li S, Xue Q, Pan X, Deng L. Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1316.
2023年7月5日，重慶醫科大學附屬第一醫院鄧亮博士團隊在《Clin Transl Med》雜志發表題為“Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression”的研究論文，該研究以人和小鼠的肝星狀細胞(hepatic stellate cells HSC)為研究對象，通過RNA-seq和ChIP-seq等分析揭示Runx2在肝纖維化過程中通過轉錄調控Itgav（(integrin alpha-V)表達對HSC活化至關重要，提示Runx2可能是肝纖維化的一個潛在治療靶點。
標題：Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression（Runx2通過轉錄調控Itgav表達活化肝星狀細胞以促進肝纖維化）
時間：2023-07-05
期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：IF 10.6
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
研究摘要：
本研究分析結果表明，Runx2表達在不同病因的人肝纖維化中顯著上調；在小鼠肝纖維化過程中，Runx2表達也逐漸上調，且Runx2主要在活化的HSC中表達。HSC中Runx2敲除可以顯著減少由CCl4誘導、由1,4-二氫-2, 3,5-吡啶二甲酸二乙酯（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine）（DDC）誘導、由蛋氨酸膽堿缺乏癥（MCD）誘導的肝纖維化，而肝通過注射HBAAV-Runx2或VA-Lip-Runx2的Runx2過表達加劇了CCl4誘導的肝纖維化。體外實驗分析表明，Runx2促進HSC的活化和增殖，而在HSC中Runx2的敲除則抑制了這些作用。RNA-seq和Runx2的ChIP-seq分析表明，Runx2可以通過與其啟動子結合以促進整合素α - v (integrin alpha-V，Itgav)表達。阻斷Itgav表達可減少Runx2誘導的HSC活化和肝纖維化。此外研究還揭示了細胞因子（TGF-β1、PDGF、EGF）通過蛋白激酶A（PKA）促進HSC中Runx2表達和核轉位(nuclear translocation)。
Runx2促進HSC活化和肝纖維化過程的示意圖
研究結果
（1）Runx2表達在肝纖維化過程中逐漸上調
圖1：Runx2表達在肝纖維化發展過程中逐漸上調。
（B-C） Western blot分析和qRT-PCR檢測人非纖維化或肝硬化肝樣品中Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（D） 從非纖維化或肝硬化患者采集人肝臟組織樣本。對各組肝臟組織中代表性的Masson組織學、α-SMA和Runx2的IHC染色分析。ImageJ軟件定量檢測陽性染色區域。比例尺：50μm（n=10）。
（E） 與對照樣品相比，Runx2在GSE31431小鼠肝纖維化組織中的mRNA表達。
（F-G）腹腔注射CCl4（5μL/G體重）誘導小鼠肝纖維化4周。Western blot和qRT-PCR分析肝臟組織Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（H） 小鼠被喂食高脂肪飲食12個月以誘導NASH相關纖維化。IP注射CCl4誘導小鼠肝纖維化4周。對各組肝臟組織中代表性Masson組織學、α-SMA和Runx2的IHC染色。ImageJ軟件定量測量陽性染色區域。比例尺：50μm（n=6）。數據為平均值±SEM，*p、**p<0.05與對照組比較#p＜0.01；ns，不顯著。
（2）Runx2特異性位于體內活化的HSC中，并在體外HSC活化過程中以時間依賴性方式增加
圖2：Runx2在體內特異性位于活化的HSC中，并在體外HSC活化過程中以時間依賴性方式增加。
（A） CCl4處理的小鼠和肝硬化患者肝切片的免疫熒光顯微圖，活化HSC（α-SMA，紅色）、內皮細胞（CD31，紅色）和Kupffer細胞（F4/80，紅色）染色，Runx2為綠色。比例尺：小鼠20μm；50μm（n=3）。（B） 以olive或CCl4處理小鼠4周后，分離出原代HSC，然后RNA-seq分析檢測沉默HSC（qHSC，olive）和活化HSC（aHSC，CCl4），并進行火山圖分析。
（C） 小提琴圖顯示了每個聚類所選標記基因（Runx2、α-SMA和Col1a1）的相對表達；平均每個條件1000個細胞。
（D-E）從正常小鼠肝臟中分離原代HSC，并在指定時間間隔（第1、4和7天）培養。Western blot和qRT-PCR檢測Runx2、α-SMA、I型膠原（collagen I）和TGF-β1的蛋白和mRNA表達（n=5）。
（F） Runx2和α-SMA在指定時間間隔培養的原代HSC中的免疫熒光染色。顯示高倍圖像（n=3）。數據為平均值±SEM，與對照組相比*p＜0.05。
（3）HSC特異性敲除Runx2可以減少CCl4誘導、DDC誘導或MCD誘導的小鼠肝纖維化
圖3：HSC特異性敲除Runx2可以減少CCl4誘導、DDC誘導或MCD誘導的小鼠肝纖維化
（A） 小鼠HSC特異性敲除Runx2的構建策略示意圖（Runx2△+HSC）。（B-C）用olive或CCl4處理HSC小鼠4周，利用Western blot和qRT-PCR分析Runx2、I型膠原和α-SMA在Runx2f+ 和Runx2△+HSC中的蛋白質和mRNA水平（n＝3）。
（D） 用olive或CCl4處理的Runx2f+和Runx2小鼠肝臟組織中I型膠原和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）。
（E） Runx2f+和Runx2△+HSC小鼠用0.1%的DDC喂養4周以誘導膽汁淤滯，或用MCD喂養8周以誘導NASH。顯示了a-SMA的H&E、Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=3）。
（4）Runx2過表達加劇了CCl4誘導的肝纖維化
圖4：Runx2過表達加劇了CCl4誘導的肝纖維化
（B-C）Western blot和qRT-PCR檢測Runx2、I型膠原和α-SMA的蛋白和mRNA表達（n=3）。
（D） 經olive或CCl4處理的HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中膠原I和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性圖像。比例尺：100μm（n=5）。
（5）Runx2在體外調控HSC活化
圖5：Runx2在體外調控HSC活化
（A） Runx2小鼠的HSC特異性缺失策略示意圖（Runx2△/△HSC）。（B） 從Runx2△/△HSC或HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC，并在3%FBS條件下培養4天。
（C） 從Runx2f/f 或 Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過qRT-PCR測定纖維相關基因。
（D） Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1在Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC中的Western blot分析。
（E-F）通過qRT-PCR和Western blot分析從HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中分離的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1的mRNA和蛋白表達。
（G-H）通過流式細胞術分析原代HSC中各個細胞周期階段的指數生長百分比。
（I） 從Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過免疫熒光染色檢測α-SMA活化特征（n＝3）。
（6）Itgav是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點
圖6：Itgav(integrin alpha-V)是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點
（B） 對從HBAAV-Runx2小鼠分離的原代HSC進行Runx2 ChIP-seq分析，并對DEG進行KEGG通路富集分析。
（C） 通過ChIP-seq分析，對348個啟動子與Runx2結合基因和183個TGF-β通路相關基因進行交叉分析。
（D） 基因組圖譜顯示Itgav轉錄啟動子區的Runx2結合位點（Chr2:8372357-83723806）。
（E） 經pCDNA 3.1-ctrl或pCDNA 3.1-Runx2轉染的小鼠HSC細胞系上進行熒光素酶報告基因分析。
（F-G） 經CCl4處理4周的Runx2f/+、Runx2△/+HSC、HBAAV-ctrl和HBAAV-Runx2小鼠中采集肝臟組織。通過qRT-PCR和Western blot分析Itgav的mRNA和蛋白表達。
（H-I） 分別從Runx2f/f小鼠、Runx2△/△HSC小鼠、HBAAV-ctrl小鼠和HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC。用qRT-PCR分析Itgav的mRNA表達。Western blot分析Itgav及其下游激酶（FAK、pFAK、PI3K、pPI3K，Smad2/3和pSmad2/3）的蛋白表達。數據為平均值±SEM；n＝3， *p＜0.05，#p＜0.05。
（7）αv整合素抑制劑阻斷Runx2過表達引起的CCl4誘導肝纖維化加劇
圖7：αv整合素抑制劑阻斷Runx2過表達引起的CCl4誘導肝纖維化加重
（A） αv整合素抑制劑CWHM 12體外實驗的靶向處理方案。HBAAV-ctrl小鼠或HBAAV-Runx2小鼠給予CWHM-12（100mg/kg/天）或安慰劑（載體）處理1周，然后分離原代HSC。（B-C）Western blot和qRT-PCR分析原發性HSC中α-SMA的蛋白質和mRNA表達水平（n=3）。
（D） CWHM-12體內實驗的靶向處理方案。小鼠服用CCl4 2周，然后插入含有CWHM-12（100mg/kg/天）或安慰劑（載體）的Alzet微型泵，隨后再服用2周CCl4。
（E-F）qRT-PCR和Westernblot分析檢測用或不用CWHM-12處理的HBAAV-Runx2或HBAAV-ctrl小鼠的肝臟組織中α-SMA的mRNA和蛋白表達（n=3）。
（G） I型膠原和α-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）
（8）PKA調控HSC中Runx2的活化和核轉位（nuclear translocation）
圖8：PKA介導的Runx2活化和HSC核轉位
（A） 經或不經TGF-β1（5 ng/mL）、PDGF-BB（5 ng/mL）、EGF（5 mg/mL）處理，然后用DMSO或PKA抑制劑（PKI-6-22，10 nM/mL）處理12小時的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型膠原和Itgav的Western blot分析（n=3）。（B） 經或不經TGF-β1，然后用PKA活化劑（8-Bromo-cAMP，0.5 nM/mL）或抑制劑（n=3）處理的原代HSC中細胞質和細胞核內Runx2的Western blot分析。
（C） PKA抑制劑或活化劑處理的原代HSC中Runx2和α-SMA的免疫熒光染色（n=3）。
參考文獻：
Zhong L, Zhao J, Huang L, Liu Y, Pang X, Zhan K, Li S, Xue Q, Pan X, Deng L. Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1316.
標簽：
ChIP-seq
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