DNA甲基化是表觀遺傳學中最重要的修飾之一，在免疫應答中發揮著重要作用。自引進大菱鲆（Scophthalmus maximus，商品名：多寶魚）以來，養殖規模不斷擴大，其間各種細菌、病毒和寄生蟲引起的疾病日益嚴重。因此，滅活疫苗以其獨特優勢在水產品領域得到廣泛的研究和應用。然而，大菱鲆接種殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）滅活疫苗后的免疫機制尚不清楚。
 
2023年2月7日，青島農業大學海洋科學與工程學院副教授修云吉博士團隊在《Frontiers in Immunology》雜志發表題為“Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation”的研究論文，該研究通過WGBS和對應的RNA-seq分析，從DNA甲基化的角度揭示了殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）滅活疫苗免疫大菱鲆后的免疫機制。


標題：Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation（從DNA甲基化角度分析殺鮭氣單胞菌滅活疫苗對大菱鲆的免疫作用）
時間：2023-02-07
期刊：Frontiers in Immunology
影響因子：7.3 / 1區
技術平臺：WGBS、RNA-seq、雙熒光素酶報告基因實驗等
 
研究摘要：
本研究采用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）篩選差異甲基化區域（DMRs），采用轉錄組測序（RNA-seq）篩選顯著差異表達基因（DEGs）。雙熒光素酶報告實驗和DNA pull-down實驗進一步驗證了用殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）滅活疫苗免疫后基因啟動子區的DNA甲基化水平對基因轉錄活性的作用。
研究結果共篩選出8149個差異甲基化區域(differentially methylated regions, DMRs)，其中包括許多DNA甲基化水平變化的免疫相關基因。同時鑒定出386個顯著差異表達基因(DEGs)，其中許多基因在Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和C型凝集素受體信號通路中顯著富集。結合WGBS結果和RNA-seq結果分析，共有9個負調控基因的DMRs位于啟動子區，包括2個低表達的高甲基化基因和7個高表達的低甲基化基因。隨后篩選出兩個免疫相關基因：C5a過敏毒素趨化受體1樣(C5ar1-Like)基因和嗜酸粒細胞過氧化物酶樣(EPX-Like)基因，以探討DNA甲基化修飾對其表達水平的調控機制。此外，基因啟動子區的DNA甲基化水平通過抑制轉錄因子結合以影響基因轉錄活性，從而導致基因表達水平變化。
綜上，本研究通過共同分析WGBS和RNA-seq結果，從DNA甲基化角度揭示了大菱鲆用殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）滅活疫苗免疫后發生的免疫機制。
 
材料方法：

研究結果：
（1）轉錄組測序結果分析
表2：樣本數據質量

表3：樣本和參考基因組的比對

圖1：轉錄組測序篩選差異基因。
（A） Venn圖顯示了AsVSm和NVSm基因的差異。
（B） 條形圖顯示了顯著DEG數量的統計數據。
（C） 顯著DEG的聚類熱圖。橫坐標表示樣品名稱，縱坐標表示均質化后fpkm的值。紅色表示高表達，綠色表示低表達。
（D） 顯著DEG的GO富集分析。
（E） KEGG富集散點圖。AsVSm與NVSm中最顯著富集DEG的前20條通路。
 
（2）全基因組重亞硫酸鹽測序分析
表4：WGBS的output數據質量

表5：WGBS中reads與參考基因組的比率

表6：全基因組甲基化水平


表7：mC的數量和百分比分布


圖2：通過全基因組亞硫酸鹽測序篩選DMR和相關基因。
（A）基因區域上游和下游2K區域樣本甲基化水平分布。
（B）mCG序列環境中基因功能區甲基化水平的熱像圖分析結果。
（C）DMGs在不同序列環境（CG，CHG，CHH）中錨定啟動子區域的共有和獨有基因集數量。
（D）不同序列環境（CG，CHG，CHH）中DMR甲基化水平的聚類熱圖。
（E）在CG序列環境中DMG的GO富集分析。
（F）在CG序列環境中DMGs顯著富集的前20個通路。


（3）WGBS與RNA-seq的關聯分析


圖3：甲基化修飾對基因表達水平的調控
(A) CG序列環境中基因表達水平和甲基化水平的分布。
(B) DMG和DEGs之間重疊基因的統計。
(C)啟動子區CG序列環境中重疊基因的GO富集分析。
(D)顯著富集甲基化負調控基因的通路統計。


（4）DNA甲基化負調控基因表達
圖4：DNA甲基化負調控基因表達
(A) AsVSm組和NVSm組中C5ar1-Like基因的相對表達水平。
(B) AsVSm組和NVSm組C5ar1-Like基因啟動子區平均甲基化水平。
(C) AsVSm組和NVSm組EPX-Like基因的相對表達量。
(D) AsVSm組和NVSm組EPX-Like基因啟動子區平均甲基化水平。* p < 0.05。
 
 
（5）DNA甲基化抑制免疫相關基因表達的機制
圖5：DNA甲基化抑制免疫相關基因表達的機制
(A)來自C5ar1-Like和EPX-Like啟動子區的擴增片段。不同顏色代表不同的基因片段。
(B) DNA甲基化修飾對C5ar1-Like啟動子區熒光活性的影響。
(C) DNA甲基化修飾對EPX-Like啟動子區熒光活性的影響。*代表性顯著性差異(P<0.05)。
(D) HEK293T核蛋白的考馬斯藍染色(coomassie blue staining)。
(E) DNA pull down富集蛋白的銀染色（Silver staining）。紅框顯示met-SmC5ar1-Like和SmC5ar1-Like的不同條帶。
(F) MS鑒定的met-SmC5ar1-Like和SmC5ar1-Like互作蛋白的總數。

研究小結：
本研究通過WGBS和RNA-seq等分析表明，在接種殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）滅活疫苗后，大菱鲆腎組織中許多DNA甲基化水平和基因表達發生變化。此外，雙熒光素酶報告實驗和DNA pull down結果驗證了基因啟動子區DNA甲基化修飾可通過抑制轉錄因子與基因啟動子區結合而影響基因表達。本研究結果揭示了滅活疫苗對大菱鲆腎組織DNA甲基化水平和基因表達的影響，探索了DNA甲基化在大菱鲆抗性育種中的潛在應用，為大菱鲆遺傳改良提供了新思路。


參考文獻：
Li Y, Su L, Liu X, Guo H, Zhou S, Xiu Y. Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation. Front Immunol. 2023;14:1124322.