Sapphire激光掃描成像系統在HeLa細胞的STAT3/pSTAT3測定中的應用
隨著生命科學研究的深入發展，精準、高通量且通用的技術方法在細胞反應及生物過程研究中的需求愈加強烈。傳統的Western blot需要細胞裂解和破壞細胞環境，而活細胞成像通常缺乏免疫檢測的分子特異性。In-Cell Western（ICW）結合免疫熒光染色和Western blot技術優勢，可直接定量評估細胞內和周圍細胞環境中的蛋白質表達和修飾，保留關鍵的生理背景。
為確保ICW實驗數據的可靠性，全細胞染色和高級成像至關重要。全細胞染色為數據準確性和歸一化奠定了基礎，確保反映單個細胞的真實變化，而非細胞密度的差異。
為捕捉微妙、動態的細胞反應及細微差別，高性能、高分辨的激光掃描成像系統不可或缺。Sapphire FL激光掃描成像系統專為卓越生物成像而生。多重熒光檢測顯著提高實驗效率，成像通道間無信號串擾，保障數據的可靠性。結合高質量、經驗證的試劑，能有效區分特定信號，甚至可捕獲蛋白質表達中最細微的變化。
材料與方法
· 細胞培養
將HeLa細胞連續稀釋后，以115μL /孔的體積接種于96孔無菌細胞培養板中。培養皿孵育過夜，隨后用IFN-α處理4-12列的細胞15分鐘。PBS清洗后，方可進行ICW實驗。
· In-Cell Western
100%甲醇-20°C固定細胞20分鐘后，使用AzureCyto™滲透液孵育5分鐘。隨后用AzureCyto封閉液室溫振蕩封閉1小時。根據表1對細胞進行STAT3和/或pSTAT3檢測。將一抗與AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C過夜，進行全細胞染色。PBS洗滌后，將AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室溫孵育30分鐘。PBS沖洗后可進行成像。
表1.孔板列的處理及檢測參照表
· 多通道熒光成像
使用Sapphire FL 532nm、685nm和784nm標準光學模塊進行成像，分辨率為10µm，焦距設置為+3.00mm。
· 蛋白歸一化
為解釋孔間的細胞數量及蛋白含量差異，將每孔的目的蛋白信號歸一化為該孔的全細胞染色信號值。找出稀釋系列中強度最高的全細胞信號值，將其他每孔的信號值除以該最大值，得出每孔的歸一化因子。再將每孔的目的蛋白信號除以相應的歸一化因子，得到歸一化信號值。
實驗結果
pSTAT3在IFN-α作用下表達量增加，有力地證明了結合全細胞染色歸一化，ICW可有效捕獲強劑量和治療反應。考慮到孔間的細胞體積差異，全細胞歸一化有助于確保數據的可靠性和準確性。值得注意的是，在此ICW實驗中，每個掃描通道間信號無串擾，增強了數據的可靠性和完整性。
結果與討論
ICW是深入了解細胞信號和蛋白質動力學的有力工具，在高通量藥物和治療篩選方面具有廣泛而重要的應用。結合Sapphire FL此類高靈敏、高性能的先進成像系統，ICW成為一種強大的通用型工具，可捕捉蛋白表達及細胞反應的動態、微妙變化。
Sapphire FL具有5-1000μm可調節分辨率，飛克級檢測靈敏度，呈獻高質量數據。其兼容多種樣本，除了凝膠、印跡或載玻片等平面樣本，還支持孔板、培養皿和小型模式生物等厚樣本類型。
除多重熒光成像外，Sapphire FL激光掃描成像系統還可靈活實現近紅外熒光、磷屏、化學發光及可見光等多功能成像應用，賦能實驗室多樣化、更深入的科研需求！
關注我們，解鎖更多生物成像新技能，放飛科研無限想象！
咨詢熱線：400-750-7890
Azure Biosystems關于我們
Azure Biosystems成立于2013年，總部位于美國加州灣區，是一家致力于生命科學領域先進生物成像系統研發、制造、推廣及服務一體的創新型公司。擁有分子成像領域30余年經驗的卓越團隊，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系統和Sapphire激光掃描成像系統已成為技術領先的特色產品。目前，公司已形成分子凝膠成像、Western Blot、RT-PCR及配套試劑耗材等產品線。
公司成像設備全球裝機＞5000臺，用戶數量＞30000，包括美國最高科研機構NIH、梅約診所、哈佛大學、中國科學院、清華大學、諾華制藥等知名科研院所、醫院及生物醫藥企業等。截至目前，已發表大量文章，發表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等國際著名期刊雜志。
為確保ICW實驗數據的可靠性，全細胞染色和高級成像至關重要。全細胞染色為數據準確性和歸一化奠定了基礎，確保反映單個細胞的真實變化，而非細胞密度的差異。
為捕捉微妙、動態的細胞反應及細微差別，高性能、高分辨的激光掃描成像系統不可或缺。Sapphire FL激光掃描成像系統專為卓越生物成像而生。多重熒光檢測顯著提高實驗效率，成像通道間無信號串擾，保障數據的可靠性。結合高質量、經驗證的試劑，能有效區分特定信號，甚至可捕獲蛋白質表達中最細微的變化。
— 案例：HeLa細胞的STAT3/pSTAT3測定 —
材料與方法
· 細胞培養
將HeLa細胞連續稀釋后，以115μL /孔的體積接種于96孔無菌細胞培養板中。培養皿孵育過夜，隨后用IFN-α處理4-12列的細胞15分鐘。PBS清洗后，方可進行ICW實驗。
· In-Cell Western
100%甲醇-20°C固定細胞20分鐘后，使用AzureCyto™滲透液孵育5分鐘。隨后用AzureCyto封閉液室溫振蕩封閉1小時。根據表1對細胞進行STAT3和/或pSTAT3檢測。將一抗與AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C過夜，進行全細胞染色。PBS洗滌后，將AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室溫孵育30分鐘。PBS沖洗后可進行成像。
表1.孔板列的處理及檢測參照表
· 多通道熒光成像
使用Sapphire FL 532nm、685nm和784nm標準光學模塊進行成像，分辨率為10µm，焦距設置為+3.00mm。
· 蛋白歸一化
為解釋孔間的細胞數量及蛋白含量差異，將每孔的目的蛋白信號歸一化為該孔的全細胞染色信號值。找出稀釋系列中強度最高的全細胞信號值，將其他每孔的信號值除以該最大值，得出每孔的歸一化因子。再將每孔的目的蛋白信號除以相應的歸一化因子，得到歸一化信號值。
實驗結果
pSTAT3在IFN-α作用下表達量增加，有力地證明了結合全細胞染色歸一化，ICW可有效捕獲強劑量和治療反應。考慮到孔間的細胞體積差異，全細胞歸一化有助于確保數據的可靠性和準確性。值得注意的是，在此ICW實驗中，每個掃描通道間信號無串擾，增強了數據的可靠性和完整性。
結果與討論
ICW是深入了解細胞信號和蛋白質動力學的有力工具，在高通量藥物和治療篩選方面具有廣泛而重要的應用。結合Sapphire FL此類高靈敏、高性能的先進成像系統，ICW成為一種強大的通用型工具，可捕捉蛋白表達及細胞反應的動態、微妙變化。
Sapphire FL具有5-1000μm可調節分辨率，飛克級檢測靈敏度，呈獻高質量數據。其兼容多種樣本，除了凝膠、印跡或載玻片等平面樣本，還支持孔板、培養皿和小型模式生物等厚樣本類型。
除多重熒光成像外，Sapphire FL激光掃描成像系統還可靈活實現近紅外熒光、磷屏、化學發光及可見光等多功能成像應用，賦能實驗室多樣化、更深入的科研需求！
關注我們，解鎖更多生物成像新技能，放飛科研無限想象！
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Azure Biosystems關于我們
Azure Biosystems成立于2013年，總部位于美國加州灣區，是一家致力于生命科學領域先進生物成像系統研發、制造、推廣及服務一體的創新型公司。擁有分子成像領域30余年經驗的卓越團隊，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系統和Sapphire激光掃描成像系統已成為技術領先的特色產品。目前，公司已形成分子凝膠成像、Western Blot、RT-PCR及配套試劑耗材等產品線。
公司成像設備全球裝機＞5000臺，用戶數量＞30000，包括美國最高科研機構NIH、梅約診所、哈佛大學、中國科學院、清華大學、諾華制藥等知名科研院所、醫院及生物醫藥企業等。截至目前，已發表大量文章，發表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等國際著名期刊雜志。
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