Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair

Topics：Cytoskeleton, Endothelium, Cell biology, Cytoplasm, Inflammation, Biomechanics, Cell biophysics, Blood brain barrier, Cardiovascular system

 缺血性腦卒中是全球主要死亡原因之一，主要的臨床治療方法包括藥物溶栓和血栓切除術。然而，這些手術后的快速再灌注可能會損害腦功能并惡化卒中的預后，從而導致腦缺血再灌注損傷（IRI）。缺血性卒中導致腦血流量減少，使內皮細胞暴露于相對較低的剪切應力（LSS）中。有趣的是，再灌注治療可恢復生理流體剪切應力（PFSS），但也增加了更嚴重的再灌注損傷的風險。然而，FSS在再灌注損傷和修復中調節內皮功能的機制仍然難以捉摸。

許多外部生化和生物物理刺激，包括轉化生長因子-β （TGF-β） 和機械應力，都可以刺激血管內皮細胞中內皮-間充質轉化（EndMT）的發生。與 EndMT 相反，間充質-內皮轉化（MEndT）通過上調內皮相關標志物來恢復內皮細胞的特性和功能。盡管先前的研究已經證明了 EndMT 對動脈粥樣硬化病變和斑塊不穩定的貢獻，FSS 誘導的 EndMT 對腦 IRI 的影響尚未完全闡明。內皮炎癥與EndMT的發生發展密切相關。研究表明，炎癥是再灌注損傷的普遍病理特征，在繼發性腦損傷中起重要作用。然而，在再灌注治療后，由于局部生理血流的恢復，缺血性腦組織發生了更嚴重的炎癥損傷反應，這種炎癥性損傷的加重與內皮細胞功能障礙密切相關。因此，需要進一步探索腦缺血-再灌注損傷和修復過程中內皮炎癥與 EndMT 之間的關系。

作為眾所周知的機械傳感器，Yes相關蛋白（YAP）和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）對機械刺激做出反應并易位到細胞核中以啟動基因轉錄。研究表明，FSS誘導YAP從細胞膜到細胞核的易位，促進上皮-間充質轉化（EMT），并增強肝細胞癌的轉移。也有研究表明，血流依賴性 YAP/TAZ 活性調節動脈粥樣硬化的內皮表型，且YAP作為機械反應分子調節內皮炎癥。然而，在腦缺血再灌注損傷和修復期間尚不清楚 YAP 是否在調節 EndMT 和內皮炎癥反應中發揮轉錄作用。

最近，在四川大學華西基礎醫學與法醫學院生物醫學工程研究室課題人員的一項工作中，構建了大腦中動脈栓塞體內模型（MCAO）和體外平行平板流室模型，以探討FSS對IRI過程中內皮表型轉化和炎癥的影響，同時，利用mRNA測序技術檢測了觸發YAP激活的細胞骨架相關信號通路。研究結果為IRI的治療提供了新的視角。研究成果發表在 APL Bioengineering 期刊題為“Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair”。

首先，將大鼠隨機分為4組，包括Sham（假手術組）、IS（缺血2h）、IS/RE（缺血2h + 再灌注1d）和IS/RL（缺血2h + 再灌注30d），檢測了早期和晚期再灌注期間的內皮炎癥，發現早期再灌注時的炎癥明顯加重，但隨著再灌注時間的延長而緩解。通過觀察再灌注各階段中EB熒光強度，發現在再灌注早期，炎癥的加重使血腦屏障（BBB）通透性增加。并進一步觀察到BBB的緊密連接，且隨著再灌注時間的延長，BBB 的功能逐漸恢復。

為了在體外研究FSS與IRI的關系，將大鼠腦微血管內皮細胞（rBMECs）暴露于0.5 dyn/cm2 LSS 6h（LSS 組），然后將 FSS 增加到生理水平2 dyn/cm2分別持續2h（LSS/EP 組）和 12h（LSS/LP 組）。結果發現，NF-ĸB P65在早期缺血再灌注階段（LSS/EP組）從細胞質進入細胞核，這意味著內皮炎癥明顯加重（圖1 a）。值得注意的是，在 LSS 和 LSS/LP 組中，NF-ĸB P65 的定位于細胞質。此外，LSS/EP組TLR4、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TNF-α和NF-ĸB等炎癥相關因子的mRNA表達均高于LSS組和LSS/LP組（圖1 b、c）。與LSS/EP組相比，這些因子在LSS/LP組表達降低，提示內皮炎癥隨著再灌注時間的延長而減輕（圖1 b、c）。上述結果表明，缺血再灌注的早期階段（暴露于FSS，0.5-2 dyn/cm2）誘導炎癥反應加重，隨著再灌注時間的延長，rBMECs緩解了炎癥反應。

為了進一步驗證內皮炎癥誘導的BBB功能障礙，通過TEM檢查了緊密連接（TJs）的形態，發現LSS組加載6h的條件下，在相鄰的rBMECs中找到分離的TJs結構。特別是，當rBMECs暴露于2 dyn/cm2 FSS 2h時，LSS/EP組中TJs的結構在某些區域變得不規則、分離甚至丟失。此外，還檢測了每組 rBMECs 中 TJs 相關蛋白 Claudin 5、Occludin 和 ZO-1 的表達，發現與LSS組相比，LSS/EP組的表達水平顯著降低，表明炎癥加重誘導了TJs丟失，但在 LSS/LP 組中上調，表明在12h生理 FSS 條件下炎癥緩解，內皮屏障恢復。

這些發現表明，在再灌注的早期階段，通過下調TJ相關蛋白，增強的炎癥反應導致血腦屏障和內皮功能障礙。細胞逐漸適應連續的生理FSS，并恢復內皮表型和功能。

圖1 FSS誘導的內皮炎癥和血腦屏障功能障礙。

接下來，為了探究FSS調控IRI炎癥的分子機制，對暴露于FSS的rBMECs進行了第二代mRNA測序。結果顯示，與LSS組相比，LSS/EP組的內皮標志基因表達顯著下調，而間充質標志基因和炎癥相關基因的表達顯著上調。然而，與LSS/EP組相比，LSS/LP組間充質標志基因和炎癥相關基因顯著下調，而內皮標志基因顯著上調。

KEGG分析表明，顯著表達的差異基因涉及的主要信號通路為肌動蛋白細胞骨架調控、黏著斑、緊密連接、PI3K-Akt信號通路等，特別是肌動蛋白細胞骨架通路對IRI的貢獻最顯著。

根據mRNA測序結果，進一步探討了IRI和修復的機制。研究人員假設內皮細胞的內皮和間充質表型之間的轉化導致了再灌注過程中的炎癥。一方面，與體內IS組相比，IS/RE組間充質標志物明顯上調，表明EndMT發生在腦微血管內皮細胞中。然而，這些間充質標志物在 IS/RL 組中顯著降低，表明腦微血管內皮細胞中發生了逆轉的 MEndT 事件（圖2 a）。另一方面，LSS/EP 組的 VE-鈣粘蛋白（內皮標志物）從細胞膜易位到細胞質（圖2 d），其表達水平也顯著下調（圖2 e），而間充質標志物水平顯著升高（圖2 b、c）。這些結果提供了強有力的證據，表明在暴露于0.5-2 dyn/cm2 FSS的rBMECs中觸發了EndMT過程。有趣的是，隨著2 dyn/cm2的FSS從2h增加到12 h，LSS/LP組VE-鈣粘蛋白的表達顯著上調（圖2 e），而間充質標志物水平顯著下降（圖2 b、c）。

這些結果表明，FSS水平的降低觸發了rBMECs的EndMT過程，而恢復的FSS則以時間依賴性的方式導致了逆轉的MEndT事件。

圖2 連續改變FSS誘導rBMEC 表型轉化。

最后，實驗討論了FSS誘導的內皮細胞經歷EndMT和炎癥的潛在生物力學機制。在大鼠MCAO模型中發現YAP在IS/RE組中高表達并易位到細胞核。然后，通過敲低 YAP 檢測 EndMT 標志物的表達來驗證 YAP 在腦 IRI 期間 EndMT 和炎癥中的作用。與圖2的結果相反，FSS-shYAP 消除了由 VE-鈣粘蛋白上調和 N-鈣粘蛋白下調所指示的這些間充質轉化，表明 FSS-shYAP rBMECs 維持了內皮表型（圖3 a-c）。據報道，MMP-2 表達的增加通常與 EMT 的誘導有關。實驗發現，YAP敲低后，所有組的MMP2表達沒有變化。此外，與LSS相比，暴露于PFSS的sh-rBMECs中間充質標志物α-SMA的表達上調，但PFSS/EP組與PFSS/LP組間無顯著差異。同時，炎癥因子TNF-α的表達在LSS、LSS/EP和LSS/LP組均無顯著變化（圖3 d-f）。這些結果證實了YAP參與調節EndMT，與腦缺血灌注損傷和修復過程密切相關。

已知肌動蛋白細胞骨架通路對IRI的貢獻最為顯著。機械線索調節 Rho GTPases 的活性，進而導致肌動蛋白細胞骨架重塑。與靜態對照組相比，LSS組的RhoA、Cdc42和 Rac1 表達顯著上調，在LSS/EP階段顯著下調，表明 Rho GTPases 響應 FSS 并可能調節細胞骨架重塑。

此外，還探討了肌動蛋白在YAP激活中的作用。發現FSS誘導F-肌動蛋白纖維的重塑和重排，但可以被細胞骨架抑制劑Lat B顯著抑制。Lat B處理后，LSS/EP期內皮標志物表達顯著上調，間充質標志物表達顯著下調。所有組中炎癥因子TNF-α的表達均無顯著差異。這表明細胞骨架的抑制導致 rBMECs恢復內皮表型并減輕炎癥。

這些發現表明，YAP通過Rho GTPases-F-actin信號通路介導腦IRI中的EndMT。

圖3 YAP 介導的 FSS 調節腦 IRI 中的 EndMT。

圖4 FSS 誘導的內皮表型轉化導致內皮炎癥促進缺血再灌注損傷和修復的示意圖。

（a）在早期再灌注時，恢復的血流供應（剪切應力強度增加）在 ECs 中誘導 EndMT，導致炎癥和血管損傷加重。在晚期再灌注時，ECs逐漸適應生理剪切水平（剪切應力持續時間增加），恢復內皮表型（MEndT），并減輕內皮炎癥。（b）FSS 的暴露強度和持續時間不斷變化，ECs 經歷了內皮間充質表型（從 EndMT 到 MEndT），該表型依賴于 Rho GTPases——F-actin 來調節 YAP 的激活。

綜上所述，該研究證明了 FSS 在早期再灌注時從 LSS 轉變為 PFSS，通過調節 rBMECs 中的 EndMT 轉化誘導炎癥損傷和腦損傷。然而，隨著再灌注時間的增加，內皮細胞逐漸適應PFSS并經歷逆轉的MEndT，從而恢復其內皮表型，并緩解晚期再灌注期間的內皮炎癥和腦損傷。這項研究為針對IRI的治療策略提供了寶貴的見解。

參考文獻：Sun D, Ma J, Du L, Liu Q, Yue H, Peng C, Chen H, Wang G, Liu X, Shen Y. Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair. APL Bioeng. 2024 Feb 26;8(1):016110. doi: 10.1063/5.0174825. PMID: 38414635; PMCID: PMC10898918.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38414635/

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Online ISSN 2473-2877

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