林奇綜合征（Lynch Syndrome，LS）是一種常染色體顯性遺傳疾病，會導致直腸癌或其他部位罹患惡性腫瘤，約3%結直腸癌由LS引起，是最常見的遺傳性結直腸癌綜合征。

林奇綜合癥是因為錯配修復基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM等）的胚系突變所誘發的。已有研究表明7號染色體上錯配修復基因PMS2（band p22.1，如圖1）的破壞性突變與兩種遺傳性癌癥綜合征有關：體質性錯配修復缺陷（CMMRD）和林奇綜合征（LS）。7號染色體上存在有15個PMS2假基因和覆蓋PMS2基因3'部分（外顯子9-15區域）的100kb低拷貝數重復序列（LCR，又稱節段重復）。同時，反向LCR序列的第二個拷貝位于離著絲粒700kb的位置，與端粒拷貝（包含PMS2CL假基因）具有95%以上的同源性。雖然LCR間的倒位現象會導致PMS2基因活化突變，但因LCR之間相隔很遠且序列同源性高，已有NGS測序方法無法對這種復雜的情況實現檢測，亟需新的技術或方法對相關基因的大結構變異進行精準研究。

圖1.hg38參考基因組中PMS2基因位置圖

 

利用來自the Ashkenazi trio（HG002、HG003、HG004）的Coriell細胞系樣本，研究人員在體外用Cas9核酸內切酶靶向選擇切割200kb的基因組DNA片段，并通過HLS-CATCH技術平臺進行超長DNA片段回收。回收得到的200kb DNA片段，既橫跨整個端粒LCR加上LCR兩側約50kb的獨特側翼序列，又包含整個未重排的PMS2基因，因此能夠完成PMS2基因座的短讀長測序，同時不會引起著絲粒LCR或PMS2假基因的并發問題。為了測試涉及LCR區域的倒位現象，使用不同的Cas9切割端粒LCR外的相同端粒近端位點，以及在著絲粒LCR內部約50kb的獨特序列中的第二切割位點。第二次Cas9切割也將從倒位等位基因中釋放出200kb長片段，測序reads與未重排等位基因不同的模式進行拼接，其中第二切割位點和著絲粒LCR邊界之間的區域覆蓋率很高，該區域距離未重排的PMS2基因的位置約650kb。

HLS-CATCH技術平臺，是Sage Science 公司開發的SageHLS超長DNA片段回收儀結合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）技術構成。首先，將核酸裝載到Sage HLS預制膠樣品孔中進行電泳，完整的染色體DNA被截留在樣品孔中；關閉電泳并加入用于切除大部分PMS2區域的Cas9復合物(如圖2所示)；最后，消化產物通過儀器自帶的脈沖場電泳實現純化回收。繼而qPCR定性定量檢測回收產物，隨后在Illumina測序儀上進行測序分析，測序分析結果見圖3。

圖2. HLS-CATCH技術平臺

圖3.目標片段測序覆蓋情況

在基因組分析中，檢測長片段的倒位仍然是一個難題，其他方法如Strand-seq（Falconer等人，2012）、超長納米孔測序（Zhou等人，2020）和熒光標測技術（Lam等人，2012年），都需要專門的DNA提取和處理步驟。本應用中基于HLS-CATCH技術（SageHLS超長DNA片段回收儀結合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9輔助靶向染色體片段）），從細胞核（或細胞）中提取HMW DNA到Cas9酶切步驟全程自動化完成。酶切產物的片段大小直接從HLS-CATCH洗脫回收。鑒于短讀長Illumina測序成功獲取檢測目標片段的詳細情況，該方法也適用于其他由染色體重排、倒位、易位現象導致的疾病研究等。定制化基因組切割、片段大小篩選和短讀長Illumina測序的高覆蓋率分析運用，使其成為一種相對簡單且具有成本效益的大片段倒位分析方法。

Detection of large inversions involving the Lynch syndrome genePMS2 using Cas9-assisted targeted sequencing. Chris Boles,Tina Huang, Feng Chen, Sage Science, Inc., Beverly, MA.,Illumina, Inc., Foster City, CA.

 

美國Sage Science是全球領先的全自動DNA脈沖場電泳回收儀的生產廠家，擁有美國技術專利，各個型號產品可以高效完成不同長度范圍的DNA片段的精準回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學相關領域。

環亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區的獨家代理商，自2011年以來將Sage Science的產品線引入國內，一直為國內用戶提供專業的全自動核酸片段回收儀的安裝測試、應用培訓，技術支持與售后維護工作，贏得客戶的一致好評與信任。環亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。


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