文獻解讀：苜蓿單核轉錄組揭示時空共生知覺和早期反應
期刊：nature plants
影響因子：15.8
主要技術：植物單細胞抽核測序
導語
豆科植物根瘤菌共生關系的建立需要時間和細胞類型特異性地精確協調復雜的反應。遇到根瘤菌后，宿主植物中基因表達水平在最初幾小時內發生快速變化，為植物關閉防御并與微生物形成共生關系做好準備。在這里，我們應用單核 RNA 測序技術對根瘤菌處理后30分鐘、6小時和24 小時的苜蓿根系進行了表征。我們發現 30 分鐘時表皮和皮層發生了劇烈的全局基因表達重編程，這些變化中的大多數在6小時內恢復。此外，在非濃縮細胞因子處理后，植物防御反應基因在30分鐘內被激活，隨后在6小時內被抑制。我們發現，在接種點頭因子后30分鐘，招募根瘤菌所需的黃酮合成酶基因在皮層細胞中高度表達，而在其他類型的細胞中則沒有。共生固氮基因富集的基因模塊結果表明，MtFER(MtFERONIA)和LYK3(LysM域受體樣激酶3)對共生信號具有相似的響應。我們進一步發現，MtFER可以被LYK3磷酸化，并參與根瘤菌共生。我們的研究結果擴大了我們在單細胞水平上對動態時空共生反應的理解。
技術服務
植物單細胞抽核測序
研究結果
1. snRNA-seq揭示了苜蓿根的細胞異質性
為了分析早期反應的轉錄組重編程，我們在7日齡的樹干樹幼苗上接種了NFs。然后收集處理后0.5h（hpt）、6 hpt和24 hpt的根系敏感區（NFs），并接種緩沖結瘤培養基（BNM）作為模擬對照，制備snRNA-seq文庫（圖1a）。我們在4個文庫中共獲得了25276個高質量的單核轉錄組，覆蓋30469個基因，每個核的中位基因為1018個，每個核的中位唯一分子標識符（UMIs）為1390個（補充數據1）。整合scVI數據后，鑒定出10個細胞簇（圖1b和補充圖1）。然而，我們發現在統一流形近似和投影（UMAP）圖中，簇0和簇3難以區分；即使是聚類0中最特異性表達的基因在聚類3中也傾向于上調（補充圖1），這導致我們合并了這兩個細胞簇，從而得到了9個細胞簇（圖1c）。對于聚類注釋，我們使用了之前在M. truncatula中描述的15個細胞類型特異性標記（補充表1），我們能夠將大部分聚類分配到一個特定的細胞類型（圖1d和擴展數據圖1）。
圖 1
2. 廣泛表達的基因反應模式的分析
為了研究早期信號通路中基因的反應模式，我們根據每個細胞簇中不同時間點的表達情況，將4個時間點的1868個基因分為6個基因類別（圖2a和補充數據3）。共有838個不能準確地分配到這六個類別的基因被丟棄（方法）。從第2類到第6類的5個基因類別在所有細胞簇中都表現出相似的表達模式（圖2b）。接下來，我們研究了每種細胞類型對NFs的反應。通過整合四個snRNA數據集從不同的時間點，與上述結果一致，我們發現轉錄組在0.5 hpt顯示最低的相似性與其他時間點，表明根經歷了廣泛的轉錄組重編程迅速NFs刺激和逐步恢復后6hpt（圖. 2c和補充圖.6）。之前的全根研究21也揭示了根瘤菌接種后1h的瞬時重編程，我們的結果表明，瞬時重編程在表皮和皮質細胞中最為明顯，突出了這兩種細胞類型在NFs感知中的重要作用（補充圖6）。我們還發現，在0.5 hpt時的時間點特異性上調基因數量最高，證實了0.5 hpt在早期反應中的唯一性（圖2d和補充數據4）。我們通過添加一個新的生物復制來驗證了這些發現，并通過使用完全基于組合的方法（方法）分析兩個重復的數據集，獲得了高度一致的結果(擴展數據圖4。值得注意的是，對這些誘導基因的基因功能富集分析顯示，在0.5 hpt時，幾乎所有分化的細胞類型（除中柱亞型簇8外）都誘導了植物防御相關通路，特別是在表皮和皮質中。在6 hpt時，這些細胞在表皮中仍然活躍(圖2e和補充圖7–9)。
圖 2
3. 表皮細胞的一種亞型是SNF所必需的
通過重新聚類，表皮可進一步分為兩種亞細胞類型（亞簇1-0和1-1亞簇）（圖3a)。在所有四個樣本中都發現了這兩個子簇，這表明在應用NFs之前，差異導致了兩個子簇的差異（圖3b）。此外，我們的列表中 1-1specifically 表達的基因 GH9CI的 GUS 信號主要標記成熟區的根毛和表皮細胞(圖3c)，這與擬南芥根毛和表皮中根毛標記基因 AtGH9Cl的表達模式一致。與根毛在根瘤菌感染初期的重要作用一致，我們發現已知SNF 基因在子集群 1-1中的比例顯著高于 1-0(圖 3d、e和補充數據2)。此外，與叢枝菌根共生(AMS)相關的GO功能也被富集(圖3f)。
圖 3
4. MtFER與LYK3共表達
為了進一步探索它們的功能，我們在0.5hpt時提取了表皮和皮質細胞，以構建共表達網絡(圖4a和補充數據7)。結瘤所需的乙烯響應因子2（ERN2），PUB1和LYK3圖4a、c）MtFER（Medtr7g073660），擬南芥鐵藻的明顯同源物（擴展數據圖6），也在LYK3的模塊中被發現。LYK3可以磷酸化PUB1，并在早期反應中調節結瘤。此外，我們發現這三個基因的表達水平均在0.5 hpt時達到峰值，隨后逐漸下降，這表明MtFER可能與PUB1和LYK3發生相互作用（圖4d）。
圖 4
5. MtFER的表達模式與LYK3相似
我們注意到pMtFER：GUS在根尖高表達，而pLYK3：：GUS在該區域弱表達（圖5a和擴展數據圖7）。有趣的是，我們的數據顯示，在酵母雙雜交（Y2H）實驗中，MtFER蛋白可以與LYK3相互作用（圖5b）。當LYK3-FLAG和MtFER-HA在本煙草葉片中共表達時，我們通過共免疫沉淀（Co-IP）進一步證實了相互作用（圖5c）。最后，我們在體外激酶實驗中發現LYK3可以磷酸化MtFER（圖5d）。我們的研究結果表明，根瘤菌共生過程中對MtFER的需求可能與其與LYK3的相互作用有關。
圖 5
參考文獻：
[1]Liu Z , Yang J ,Long, YanpingZhang, ChiWang, DapengZhang, XiaoweiDong, WentaoZhao, LiLiu, ChengwuZhai, JixianWang, Ertao.Single-nucleus transcriptomes reveal spatiotemporal symbiotic perception and early response in Medicago[J].Nature Plants, 2023, 9(10):1734.
