入射光熒光顯微鏡的發展歷史
熒光顯微鏡先驅 Johan Sebastiaan Ploem
自上世紀中葉以來，熒光顯微鏡發展成為一種生物科學工具，對我們了解生命產生了最大的影響。在熒光分子的幫助下觀察細胞和蛋白質是當今幾乎所有生命科學學科的標準方法。這種廣泛的應用可以追溯到一些研究人員的技術工作，他們希望改進和簡化熒光顯微鏡下的勞動。荷蘭醫生約翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）就是其中的一位參與者。
外熒光顯微鏡
約翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）于 1927 年出生在蘇門答臘島的澤蘭托（Sawahlunto），是一名荷蘭煤礦工程師的兒子。幼年時，他隨父母回到荷蘭，并在那里將繪畫作為自己的愛好之一。高中畢業后，他發現了另一個令人著迷的色彩領域，我們稍后會了解到。Ploem 決定學習醫學，并在烏得勒支、哈佛和阿姆斯特丹接受教育。隨后，他開始了學術生涯，曾在邁阿密大學和阿姆斯特丹大學工作，后晉升為荷蘭萊頓大學醫學系教授。
在研究活動中，他發現熒光顯微鏡是一種強大的工具。20 世紀 60 年代，一種特殊的標本照明方式開始流行，事實上，早在 1925 年，對絲蟲自發熒光事件感興趣的 Policard 和 Paillot 就已經知道并描述了這種照明方式（Policard 和 Paillot，1925 年）。一些研究人員重新啟動了這兩位法國科學家的項目，將熒光照明和樣品檢測放在顯微鏡的同一側。這種利用入射光的原理被稱為 "Epi-Illumination"，與透射顯微鏡形成鮮明對比。在熒光顯微鏡中使用這種技術的一大好處是可以避免檢測光源發出的發射光（圖 1）。另一個優點是機械性更強：在透射照明中，聚光器和物鏡有兩個獨立的光軸，必須仔細對準。而在外延照明中，物鏡既是聚光器，又是集光物鏡。這樣就可以避免對準問題。
圖 1：外延照明在熒光顯微鏡中的優勢：在透射照明的情況下（左圖），光源和圖像檢測位于物鏡的兩側。在這種設置下，一個明顯的限制就是無法檢測到激發光（淺藍色）。相比之下，Epi-Illumination（右圖）使用物鏡進行照明和圖像檢測。對于熒光顯微鏡來說，這意味著用戶不會受到激發光的照射。
二向色分光鏡
早在幾年前，前蘇聯的兩位研究人員就為熒光外延照明顯微鏡提供了非常重要的投入。Brumberg 和 Krylova 開發了一種所謂的二向色分光器，用于入射光的紫外激發（Brumberg 和 Krylova，1952 年）。
二向色材料能夠讓特定波長范圍的光通過，而其他波長的光則被反射（圖 2）。
這一原理對于熒光外延照明是不可或缺的，因為激發光必須以某種方式融合到顯微鏡的光路中（圖 3）。更確切地說，二向色分光鏡無法穿透光源發出的所需激發光的波長，只能將激發光反射到樣品上。樣品發出的熒光反過來又可以通過二向色分光器到達檢測端。
圖 3：熒光外延照明需要一個二向色鏡（灰色），它能夠將激發光（藍色）反射到試樣上，并將發射光（綠色）傳遞到檢測端。激發光的波長可通過相應的濾光片（橙色）進行預選。朝向檢測側的濾光片（紫色）只允許熒光團的波長通過，并排除激發光的殘余雜散光。
遺憾的是，由于鐵幕之間缺乏信息交流，Ploem 并不知道俄羅斯的發展情況。盡管如此，他還是自己開始使用二向色分光鏡。針對 Ploem 的特殊情況，他與著名的特種玻璃生產商肖特公司（美因茨）共同開發了一種可反射藍光和綠光的分光鏡（Ploem，1965 年）。之后，他用 Leitz 公司提供的中性分光鏡改裝了一臺 "Opak" 外延照明器，通過引入一個帶有四個不同二向色分光鏡的滑塊，他可以在紫外線、紫光、藍光和綠光之間非常快速、方便地改變激發光的波長（Ploem，1967 年）（圖 4）。
圖 4：熒光多波長外延照明器，帶有四個安裝在滑塊中的二向色分光鏡，用于紫外、紫光、藍光和綠光的入射照明。由阿姆斯特丹大學制造（Ploem，1965 年）。
熒光濾光器立方體
開發二向色分光鏡以產生不同波長的激發光具有重要的優勢。當時，紫外光譜（約 100 nm - 380 nm）的激發光非常普遍，但卻有一個惱人的副作用：自發熒光。很多組織物質都會被紫外線激發，從而產生微弱的背景光（圖 5）。通過將二向色鏡的反射波長調整到綠色或藍色范圍，Ploem 能夠達到當時非常常用的兩種熒光染料 FITC（494 納米）和 TRITC（541 納米）的激發最大值，而不會產生自發熒光。FITC（異硫氰酸熒光素）和 TRITC（四甲基羅丹明-5（和 6）-異硫氰酸酯）可與抗體耦合，目前仍用于免疫熒光顯微鏡。通過在較小范圍內達到其激發最大值，組織標本的對比度得到了顯著增強（圖 5）。使用 Ploem 的二向色分光器產生的激發光束能有效地與 FITC 的激發最大值相匹配，即使是發射光譜很差的光源也能使用。
圖 5：左圖：用寬波段紫外激發光照射標記有免疫標記（FITC）的組織細胞。注意帶有藍色自發熒光的組織結構。右圖 使用窄波段藍光（490 納米）外延照明，對相同的組織和相同的 FITC 標記進行免疫染色。注意圖像對比度的增加（Ploem，1967 年）。
有鑒于此，現在可以利用外延照明的優勢，使用普通的高壓汞弧光燈提供藍光和綠光的窄帶激發。這一改進滿足了生命科學和醫學領域對熒光顯微鏡的需求。
根據 Ploem 的發明，Leitz 設計出了一種新型多波長熒光外延照明器，它帶有四個旋轉式二向色分光鏡，可在紫外、紫光、藍光和綠光范圍內激發標本，這就是 Leitz PLOEMOPAK。
萊茨員工卡夫（W. Kraft）取得了更大的成就，他將二向色分光器與適當的激發和發射濾光器組合在一個工件上，即所謂的濾光器立方體或濾光器塊（卡夫，1969 年和卡夫，1972 年）（圖 6）。他的研究成果是設計出了一種外延照明器，該照明器帶有多組四個這樣的濾光器立方體，如今幾乎所有的多波長熒光顯微鏡都是以這些濾光器立方體為基礎的。
總 結
有了 Ploem 及其同代人和后繼者建立起來的技術基礎，我們今天就可以通過將適當的濾光器立方體放入外延照明器（圖 7），觀察到無數不同的熒光團。研究人員甚至可以根據自己的需要定制激發和發射參數。
由于現代研究顯微鏡的自動化，在實驗過程中切換濾光器立方體只需點擊一下按鈕�？茖W家們可以在一瞬間切換不同的熒光團，從而觀察到即使是活體標本也被熒光標記為不同的熒光團。
參考文獻：
1.Brumberg, E. M., Krylova, T. N.: O fluoreschentnykh mikroskopopak. Zh. obshch. biol. 14, 461, 1953.
2.Ploem, J. S.: Die Möglichkeit der Auflichtfluoreszenzmethoden bei Untersuchungen von Zellen in Durchströmungskammern und Leightonröhren. Xth Symposium d. Gesellschaft f. Histochemie, 1965. Acta Histochem. Suppl. 7, 339–343, 1967.
3.Ploem, J. S.: The use of a vertical illuminator with interchangeable dichroic mirrors for Fluorescence microscopy with incident light. Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie 68, 129–142, 1967.
4.Kraft, W.: Die Technologie des Fluoreszenzopak, Leitz Mitt. Wiss. u. Techn. IV/6, 239–242, 1969.
5.Kraft, W.: Fluorescence Microscopy and Instrument Requirements. Leitz Mitt. Wiss. u. Techn. V/7, 193–206, 1972.
6.Policard, A., Paillot, A.: Etude de la sécrétion de la soie à I'aide des rayons ultraviolets filtrés (lumière de Wood). Comptes Rendus de l'Académie des Sciences Paris 181, 378–380, 1925.
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