光片熒光顯微鏡簡介

光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種快速發(fā)展的體積成像技術，因其速度快、靈敏度高、光學分層能力強以及低光毒性和低光漂白而受到生命科學家的青睞。在LSFM中，生物標本被聚焦的光片照亮，熒光通過現代科學相機以寬視場格式捕獲。與傳統(tǒng)的表面熒光成像方法不同，LSFM限制了對焦區(qū)域以外的潛在有害照明，從而減少了光毒性和光漂白，提高了成像對比度。

在《Systematic and Quantitative Comparison of Lattice and Gaussian Light-Sheets》一文中，作者Bo-Jui Chang、Kevin M. Dean和Reto Fiolka 系統(tǒng)比較了基于不同光束光片的物理性質。盡管近年來新的光束因其窄光腰和傳播不變特性受到關注，但關于其物理性質及其與標準高斯光束相比的研究卻很少。本文通過實驗測量了最常用的方形光柵光片和高斯光片的光束特性，發(fā)現兩者在厚度、共焦參數、傳播長度和整體成像性能方面非常相似。本文旨在對這些研究結果進行解讀，明確其對光片熒光顯微鏡（LSFM）領域的研究人員和實踐者的影響。

關鍵概念和方法

這篇文章重點討論了兩種主要的光片類型：高斯光束和常用于LLSM的抖動方格光柵(dithered square lattice)。作者詳細介紹了生成和分析這些光片的實驗設置，包括使用488納米激光器、空間光調制器以及各種光學元件來成形和測量光片。

圖1.由方形光柵和高斯光片照明的3D圖像堆疊中的珠子在YX和YZ最大強度投影（MIP），傳播長度分別為(A) 12 μm, (B) 19 μm, (C) 32 μm 和 (D) 40 μm。

表格1. 方形光柵和高斯光片的橫向和軸向分辨率是通過100納米熒光納米球測量的。使用雙樣本T檢驗評估統(tǒng)計顯著性。

在40um 傳播長度處，高斯光束表現出更好的軸向分辨率。

光片特性的測量包括以下三個參數：

1、光束束腰處Z方向的光片厚度。

2、Y方向的光片傳播長度。

3、共焦參數，測量光片厚度增加到其最小值的√2倍的距離。

光片特性的比較

01、光束厚度和傳播長度

研究表明，高斯光片和方格光柵光片在光束腰厚度和傳播長度方面表現出相似的特性。這一發(fā)現具有重要意義，因為它挑戰(zhàn)了之前認為光柵光片由于其傳播不變性而具有更優(yōu)越的軸向分辨率的觀點。

圖2. 高斯光片和方形光片顯微鏡的點擴散函數 (PSF) 和光學傳遞函數 (OTF)。(A) 數值孔徑 (NA) 為 0.31、0.24 和 0.14 的高斯光片，以及數值孔徑為 0.70 和 0.56、0.55 和 0.44、0.35 和 0.28 的方形光片的光束輪廓。展示了 YZ 和 XZ 的橫截面視圖。每個光片在中心（最薄的腰部）的 XZ 視圖。箭頭指向有用光片邊緣和方形光片旁瓣的不同之處。NA：用于方形光片的環(huán)形外數值孔徑；na：用于方形光片的環(huán)形內數值孔徑。(B) 沿傳播方向的光束大小測量。(C) 光片厚度的測量。

02、光學性能

作者細致地測量了兩種光片的點擴散函數（PSF）和光學傳遞函數（OTF）。

圖3. 方形光柵和高斯光片顯微鏡的點擴散函數（PSF）和光學傳遞函數（OTF）。所有PSF和OTF圖像均應用了0.8的伽馬校正，以增加弱特征的對比度。選擇具有類似共焦參數的高斯光片以與光柵光片進行比較。PSF的比例尺為1 μm。

結果表明，高斯光片和方格光柵光片具有相似的PSF和OTF，表明它們在實際應用中的成像性能幾乎沒有區(qū)別。

03、共焦參數

兩種光片在光片厚度與共焦參數之間表現出相似的關系。然而，由于生成和調節(jié)這些光束的復雜性，方格光柵光片表現出略大的可變性。

圖4. (A) 光片厚度與光片傳播長度的關系。厚度的測量方法如圖1(C)所述，傳播長度的測量方法如圖1(D)所述。(B) 光片厚度與共焦參數的關系。共焦參數的測量方法見原文。

實驗結果

研究表明，大多數LLSM實驗可以使用傳統(tǒng)的高斯光片完成，從而簡化了系統(tǒng)的組裝、對準和操作。此外，使用高斯光片所需的激光輸入功率更少，并且更容易實現多色同時激發(fā)。研究結果強調了線性光學中的基本物理定律，即隨著共焦參數的增加，光片厚度和旁瓣強度也會增加。

圖5. 寬場、高斯光片顯微鏡和方形光柵光片顯微鏡的PSF和OTF。為了增強弱特征的對比度，所有PSF和OTF圖像均應用了0.5的伽馬校正。沿OTF中心虛線的剖面圖（未進行伽馬校正）清晰顯示了OTF的支持范圍。PSF中的比例尺為1 μm。

實踐意義

研究結論表明，對于大多數LLSM應用，傳統(tǒng)的高斯光片與方格光柵光片的性能相當。這對LSFM系統(tǒng)的設計和使用具有實際意義，表明無需復雜的光柵配置，使用更簡單、更直觀的高斯光片即可實現類似的結果。

本文為熒光顯微技術領域做出了重要貢獻，提供了清晰且數據驅動的比較，可以指導未來光片成像技術的研究和發(fā)展。

參考文獻：

Chang, B-J., Dean, K. M., & Fiolka, R. (2020). Systematic and quantitative comparison of lattice and Gaussian light-sheets. Optics Express, 28(18), 27052-27065. DOI: 10.1364/OE.400164

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