RNA Pull Down和RIP的技術應用
RNA Pull Down和RIP的技術應用：ELF18誘導的lncRNA ELENA1與MED19a互作
增強擬南芥免疫反應
增強擬南芥免疫反應
植物和動物在自然環境中都面臨著被各種微生物感染的風險。與動物一樣，植物也演化出了一套模式識別受體（PRRs），這些受體能識別整個微生物病原體類別的分子特征，進而啟動先天免疫反應。本文鑒定了擬南芥中一種長非編碼RNA（lncRNA）-ELENA1，通過In Vitro RNA Pull-Down、RIP等技術揭示了ELENA1調控擬南芥抗病性的機制。
1、ELENA1通過受體依賴途徑表達
為探究lncRNA在植物免疫中的調節途徑，作者通過T-DNA插入得到敲除突變體efr-2和fls2，使用elf18及flg22處理后，通過RT-PCR分析發現，與野生型對比受體敲除株efr-2和fls2中的ELENA1被抑制轉錄。此外ELENA1啟動子-GUS分析證實其啟動子攜帶對elf18和flg22高度響應的順式作用元件。以上結果表明ELENA1轉錄是通過受模式識別受體（PRR）依賴途徑調節的。
為探究lncRNA在植物免疫中的調節途徑，作者通過T-DNA插入得到敲除突變體efr-2和fls2，使用elf18及flg22處理后，通過RT-PCR分析發現，與野生型對比受體敲除株efr-2和fls2中的ELENA1被抑制轉錄。此外ELENA1啟動子-GUS分析證實其啟動子攜帶對elf18和flg22高度響應的順式作用元件。以上結果表明ELENA1轉錄是通過受模式識別受體（PRR）依賴途徑調節的。
圖1.ELENA1的轉錄水平由elf18和flg22誘導
2、ELENA1作為lncRNA正調控植物抗病性
為了研究ELENA1是作為非編碼RNA還是編碼RNA在植物先天免疫中發揮功能，作者首先構建了兩種不同的突變植物35S:5m_ELENA1（ELENA1_5M）和35S:8m_ELENA1（ELENA1_8M）。分析了四種不同ELENA1表達水平（1800-3200倍）的過表達株系，發現過表達植株中ELENA1的轉錄水平已經高于PR1表達的飽和水平，ELENA1的表達水平不會顯著影響PR1的表達水平。同時使用elf18對ELENA1過表達的轉基因植物進行處理，與野生型相比PR1 表達水平與ELENA1相似均有所增加。
隨后作者通過人工miRNA構建了ELENA1過表達株和敲除株。使用Pst DC3000處理，通過表型觀察，RT-qPCR等實驗發現，與野生型相比，ELENA1敲除株對Pst DC3000的耐受性更低，而ELENA1過表達株的耐受性更高。同時PR1和PR2的表達情況與ELENA1呈現出相同的趨勢。以上結果表明ELENA1作為lncRNA正調控PR相關基因的表達來抵抗細菌病原體。
為了研究ELENA1是作為非編碼RNA還是編碼RNA在植物先天免疫中發揮功能，作者首先構建了兩種不同的突變植物35S:5m_ELENA1（ELENA1_5M）和35S:8m_ELENA1（ELENA1_8M）。分析了四種不同ELENA1表達水平（1800-3200倍）的過表達株系，發現過表達植株中ELENA1的轉錄水平已經高于PR1表達的飽和水平，ELENA1的表達水平不會顯著影響PR1的表達水平。同時使用elf18對ELENA1過表達的轉基因植物進行處理，與野生型相比PR1 表達水平與ELENA1相似均有所增加。
隨后作者通過人工miRNA構建了ELENA1過表達株和敲除株。使用Pst DC3000處理，通過表型觀察，RT-qPCR等實驗發現，與野生型相比，ELENA1敲除株對Pst DC3000的耐受性更低，而ELENA1過表達株的耐受性更高。同時PR1和PR2的表達情況與ELENA1呈現出相同的趨勢。以上結果表明ELENA1作為lncRNA正調控PR相關基因的表達來抵抗細菌病原體。
圖2. ELENA1敲除與過表達株系的防御表型
3.ELENA1正調控elf18誘導的免疫反應的基因
為了探究ELENA1在調節免疫反應中的作用及其調節的基因，使用elf18分別處理野生型和ELENA1過表達株系0 h、1 h、6 h、12 h后，通過聚類分析、基因本體富集分析，發現具有系統獲得性抗性、免疫反應和防御反應相關的基因顯著富集，表明ELENA1正向調節elf18誘導的防御基因。同時鑒定出了145個在野生型和過表達ELENA1植株中表達水平增加的防御基因，最終通過篩選將PR1、PR2、CRK7、BG3和CYP82C2定為靶標基因，通過RT-PCR實驗驗證以上基因在ELENA1過表達株和敲除株中的表達情況，結果顯示以上靶標基因在ELENA1過表達和敲除株中的表達水平顯示出明顯的負相關。這些結果證實了ELENA1正向調節對elf18有反應的選擇性防御相關基因的表達。
為了探究ELENA1在調節免疫反應中的作用及其調節的基因，使用elf18分別處理野生型和ELENA1過表達株系0 h、1 h、6 h、12 h后，通過聚類分析、基因本體富集分析，發現具有系統獲得性抗性、免疫反應和防御反應相關的基因顯著富集，表明ELENA1正向調節elf18誘導的防御基因。同時鑒定出了145個在野生型和過表達ELENA1植株中表達水平增加的防御基因，最終通過篩選將PR1、PR2、CRK7、BG3和CYP82C2定為靶標基因，通過RT-PCR實驗驗證以上基因在ELENA1過表達株和敲除株中的表達情況，結果顯示以上靶標基因在ELENA1過表達和敲除株中的表達水平顯示出明顯的負相關。這些結果證實了ELENA1正向調節對elf18有反應的選擇性防御相關基因的表達。
圖3. ELENA調控elf18誘導的免疫反應基因
4.ELENA1與MED19a在體內和體外均存在相互作用
為檢驗擬南芥中ELENA1與介體亞基之間可能的直接相互作用，作者使用BindN軟件篩選了一組可能具有RNA結合位點的中介體亞基。隨后利用RNA Pull-Down技術鑒定與ELENA1結合的中介體亞基，結果顯示MED19a與MED26b均能在體外與ELENA1 RNA結合，同時利用elf18處理MED19a/MED26b敲除株，發現只有MED19a敲除株中PR1表達情況顯示出與ELENA1敲除株系相似的趨勢。進一步利用GFP標記法、TriFC、RIP實驗證明中介體亞基MED19a與ELENA1在體內也存在相互作用。以上結果說明MED19a是PR1表達的主要調節因子，與ELENA1在體內和體外均存在相互作用，并且這種相互作用在elf18處理后得到增強。
為檢驗擬南芥中ELENA1與介體亞基之間可能的直接相互作用，作者使用BindN軟件篩選了一組可能具有RNA結合位點的中介體亞基。隨后利用RNA Pull-Down技術鑒定與ELENA1結合的中介體亞基，結果顯示MED19a與MED26b均能在體外與ELENA1 RNA結合，同時利用elf18處理MED19a/MED26b敲除株，發現只有MED19a敲除株中PR1表達情況顯示出與ELENA1敲除株系相似的趨勢。進一步利用GFP標記法、TriFC、RIP實驗證明中介體亞基MED19a與ELENA1在體內也存在相互作用。以上結果說明MED19a是PR1表達的主要調節因子，與ELENA1在體內和體外均存在相互作用，并且這種相互作用在elf18處理后得到增強。
圖4. ELENA1與MED19a相互作用
5.ELENA1和MED19a相互作用調控PR1表達
為了研究ELENA1、MED19a、PR1表達間的關系，作者構建了四種不同的ELENA1和MED19a的雙轉基因株系分別為35S:ELENA1/med19a-1(E1/m19a)、ELENA1KD-10/UBQ:MED19a(e1#10/M19a)、ELENA1KD-10/med19a-1 (e1#10/m19a)和35S:ELENA1-16/UBQ:MED19a (E1#16/M19a)。使用elf18進行處理，通過RT-qPCR實驗對不同株系的相關基因表達情況進行分析。結果顯示，E1/m19a株系與ELENA1過表達植物 (E1#16) 相比PR1表達顯著下降，但略高于med19a-1突變體(m19a)。在ELENA1 KD突變體背景中，MED19a的過表達(e1#10/M19a)對PR1表達沒有顯著影響，與e1#10/M19a相比E1#16/M19a株系PR1表達更高，說明ELENA1和MED19a相互作用進一步增強PR1表達。以上結果說明在elf18處理下，MED19a對PR1表達的促進作用依賴于ELENA1，但在MED19a之外，還有其他因素與ELENA1相關聯以促進PR1表達。
為了研究ELENA1、MED19a、PR1表達間的關系，作者構建了四種不同的ELENA1和MED19a的雙轉基因株系分別為35S:ELENA1/med19a-1(E1/m19a)、ELENA1KD-10/UBQ:MED19a(e1#10/M19a)、ELENA1KD-10/med19a-1 (e1#10/m19a)和35S:ELENA1-16/UBQ:MED19a (E1#16/M19a)。使用elf18進行處理，通過RT-qPCR實驗對不同株系的相關基因表達情況進行分析。結果顯示，E1/m19a株系與ELENA1過表達植物 (E1#16) 相比PR1表達顯著下降，但略高于med19a-1突變體(m19a)。在ELENA1 KD突變體背景中，MED19a的過表達(e1#10/M19a)對PR1表達沒有顯著影響，與e1#10/M19a相比E1#16/M19a株系PR1表達更高，說明ELENA1和MED19a相互作用進一步增強PR1表達。以上結果說明在elf18處理下，MED19a對PR1表達的促進作用依賴于ELENA1，但在MED19a之外，還有其他因素與ELENA1相關聯以促進PR1表達。
圖5. PR1在ELENA1和MED19a雙突變體中表達情況
6.ELENA1促進MED19a富集于PR1啟動子
為了研究ELENA1和MED19a是直接還是間接調控PR1基因表達，作者構建了轉基因株系PMED19a:GFP-MED19a，通過染色質免疫沉淀（ChIP）、qPCR定量實驗顯示MED19a富集在含有AS-1類似元素的PR1啟動子P4區域。使用elf18進行處理，發現MED19a在PR1啟動子上的富集在處理后6小時達到最高，在12小時減少。同時觀察了突變體中MED19的富集情況，與野生型相比，在ELENA1敲除株系中MED19a在PR1啟動子P4區域的富集大幅減少，而ELENA1過表達株系中MED19a的富集增加。以上結果說明ELENA1促進了MED19a在PR1啟動子上的富集。
為了研究ELENA1和MED19a是直接還是間接調控PR1基因表達，作者構建了轉基因株系PMED19a:GFP-MED19a，通過染色質免疫沉淀（ChIP）、qPCR定量實驗顯示MED19a富集在含有AS-1類似元素的PR1啟動子P4區域。使用elf18進行處理，發現MED19a在PR1啟動子上的富集在處理后6小時達到最高，在12小時減少。同時觀察了突變體中MED19的富集情況，與野生型相比，在ELENA1敲除株系中MED19a在PR1啟動子P4區域的富集大幅減少，而ELENA1過表達株系中MED19a的富集增加。以上結果說明ELENA1促進了MED19a在PR1啟動子上的富集。
圖6. ELENA1促進PR1啟動子上MED19a的富集
小結：植物的免疫反應是一個涉及基因表達和轉錄后調控的復雜的過程。本文鑒定了擬南芥中一種長非編碼RNA（lncRNA）-ELENA1。ELENA1能夠增強擬南芥對細菌病原體的抵抗力，其機制是通過與中介體亞基MED19a相互作用，并影響MED19a在抗病相關基因PR1啟動子上的富集，從而調控PR1的表達。這一發現揭示了lncRNA在植物先天免疫中的重要作用，為理解植物免疫反應的復雜性提供了新的視角。
藍景科信技術簡介
RNA Pull Down
RNA Pull Down是根據已知的RNA序列，設計DNA模版，然后使用體外轉錄技術合成帶標記的RNA探針，并與蛋白提取液進行孵育，形成RNA-蛋白質復合體。使用鏈霉親和素磁珠純化富集RNA-蛋白質復合體，將富集到的蛋白質進行LC-MS/MS檢測，最終鑒定出與RNA互作的蛋白質。
RNA Pull Down是根據已知的RNA序列，設計DNA模版，然后使用體外轉錄技術合成帶標記的RNA探針，并與蛋白提取液進行孵育，形成RNA-蛋白質復合體。使用鏈霉親和素磁珠純化富集RNA-蛋白質復合體，將富集到的蛋白質進行LC-MS/MS檢測，最終鑒定出與RNA互作的蛋白質。
RNA 免疫共沉淀測序（RIP-Seq）
RNA免疫共沉淀測序（RNA Immunoprecipitation Sequencing, RIP-seq）是研究細胞內RNA與蛋白質結合的技術。原理是利用目標蛋白的特異性抗體，將對應的蛋白-RNA復合體進行免疫沉淀，對分離純化的RNA進行建庫與高通量測序。
RNA免疫共沉淀測序（RNA Immunoprecipitation Sequencing, RIP-seq）是研究細胞內RNA與蛋白質結合的技術。原理是利用目標蛋白的特異性抗體，將對應的蛋白-RNA復合體進行免疫沉淀，對分離純化的RNA進行建庫與高通量測序。
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RNA Pull Down
RIP-Seq
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