蛋白純化是重組蛋白生產流程中關鍵的下游步驟（Fig.1）。由于重組蛋白自身在化學與結構上的多樣性，親和標簽已成為實現高通量蛋白純化的有效手段，可在復雜背景下特異性富集低豐度蛋白，不僅可以提高目標蛋白質的產量還可賦予目標蛋白質新的特性^[1]。
His-Tag（通常為 6 個組氨酸）作為目前最常用的蛋白質純化親和標簽[2]，具有以下特點：
• 分子量小，易表達，免疫原性低
• 可與其他標簽構建組合標簽
• 洗脫條件溫和，易于再生
• 成本低

Fig. 1  A. 通過與目標蛋白基因融合的His 標簽獲得純重組多肽流程示意圖

B. Ni-NTA 和組氨酸咪唑環之間配位鍵的放大顯示^[3]

注：活動順序涉及基因設計、克隆、細胞轉化、生產、

基于 His 標簽在鎳柱（I）中結合，

隨后使用咪唑（II）進行洗脫。
 

組氨酸殘基中咪唑環的給電子體基團可與金屬形成配位鍵[4]，因此，在純化過程中，改變標簽蛋白與金屬離子之間作用力的強弱即可純化目標蛋白。
純化時，通常選擇在緩沖液中加入高濃度的咪唑，咪唑與組氨酸標簽蛋白競爭性結合金屬離子，將目標蛋白洗脫下來。
此外，也可適當降低緩沖液 pH，以此減弱標簽蛋白與金屬離子結合能力，達到蛋白分離純化的目的。

Fig. 2  組氨酸與咪唑結構式
 

針對 His 標簽蛋白的純化，博格隆提供了三類 His 標簽純化產品（Fig.3），包括已鰲合 Ni²⁺ 的 Ni Bestarose FF/HP 以及未預先鰲合金屬離子的 IMAC Bestarose FF/HP 與 Chelating Bestarose FF。

Fig.3  博格隆 His 標簽純化產品

Ni Bestarose FF/HP 是將金屬離子 Ni²⁺ 鰲合在以氨三乙酸（NTA）為配基的 6% 高度交聯的瓊脂糖凝膠上的親和層析介質。
其中，Ni Bestarose FF 平均粒徑為 90 μm，具有載量高、流速快、易再生等優點；Ni Bestarose HP 平均粒徑為 34 μm，相較于 Ni Bestarose FF，具有更高的分辨率。
IMAC Bestarose HP/FF 與 Chelating Bestarose FF 均是未預先鰲合金屬離子的介質，可供客戶自行選擇金屬離子（Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺等）進行偶聯。
IMAC 與 Chelating 在配位方式上有所不同，Chelating Bestarose FF 介質的配基可提供 3 個配位位點同金屬離子螯合，同時提供 3 個離子鍵結合部位高親和地純化目的蛋白；IMAC Bestarose FF 介質提供 4 個配位位點同金屬離子螯合，2 個離子鍵結合部位純化目的蛋白（Fig. 4）。

Fig.4  氨三乙酸（NTA）與亞氨基二乙酸（IDA）配位方式

在相同的配基密度、相同金屬離子條件下，Chelating Bestarose FF 介質較 IMAC Bestarose FF 的親和力更強，但同時 IMAC Bestarose FF 介質因為多一個金屬離子螯合位點，結合金屬離子的能力更強，還可以同還原劑 DTT 及 β- 巰基乙醇兼容。因此，在純化重組組氨酸標簽蛋白時應根據蛋白特點選擇介質。

Fig.5  His 標簽蛋白純化親和填料選擇指南
 

使用 Ni Bestarose FF 純化帶有 His 標簽的熒光蛋白
• 填料：Ni Bestarose FF （1 mL EzFast）；
• 樣品：大腸桿菌裂解液；
• Buffer A：25mM咪唑   pH 7.0；
• Buffer B：500mM咪唑   pH 7.0；
• 流速：1 mL/min。

Fig.6  Ni Bestarose FF 純化熒光蛋白層析圖譜及SDS-PAGE 結果

如 Fig.6 所示，Ni Bestarose FF 具有良好的純化效果。
Tips：由于 Ni 柱不可耐受 DTT、EDTA 等強還原劑與強螯合劑，一般在進行蛋白純化之前建議通過透析或脫鹽的方式進行置換緩沖液。
在產品選擇方面，推薦使用 Bestdex G-25 M 凝膠過濾填料或預裝柱進行脫鹽或緩沖液置換。
Bestdex G-25 M 具有親水多孔的特點，利用分子篩原理可快速便捷地處理高達脫鹽柱總體積 30％ 的樣品，有效提高His標簽蛋白與 Ni 柱結合能力，同樣經 Ni 柱純化后的洗脫樣品也可使用 Bestdex G-25 M 去除高濃度咪唑。
 

Table1．Ni填料技術參數

Table2．金屬鰲合親和填料技術參數

Table3．Bestdex G-25 M技術參數

參考文獻
[1] Loughran ST, Bree RT, Walls D. Purification of Polyhistidine-Tagged Proteins. Methods Mol Biol. 2017; 1485:275-303.
[2] Waugh DS. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 2005 Jun;23(6):316-20.
[3] López-Laguna H, Voltà-Durán E, Parladé E, Villaverde A, Vázquez E, Unzueta U. Insights on the emerging biotechnology of histidine-rich peptides. Biotechnol Adv. 2022 Jan-Feb; 54:107817.
[4] Watly J, Simonovsky E, Wieczorek R, Barbosa N, Miller Y, Kozlowski H. Insight into the coordination and the binding sites of Cu (2+) by the histidyl-6-tag using experimental and computational tools. Inorg Chem. 2014 Jul 7;53(13):6675-83.