親和蛋白純化是一種基于蛋白質與特定配體之間的特異性結合的純化技術，廣泛用于分離具有生物學功能的目標蛋白。以下是具體實驗步驟：

以下所用的儀器為輝因科技的蛋白純化系統Hass25，具體配置為：雙泵梯度，最大流速25mL/min,多波長190-500nm的檢測器。雙板位收集器。圖為以下：

Hass25 蛋白純化系統

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1. 實驗原理

親和純化利用目標蛋白和配體之間的高特異性相互作用，將目標蛋白從復雜的混合物（如細胞裂解液）中分離出來。常見配體包括抗體、金屬離子、底物類似物等。

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2. 實驗材料與設備
材料：

• 待純化的蛋白質樣品：如細胞裂解液、培養上清等。
• 親和層析柱：選擇與目標蛋白特異結合的填料。
  • 常見填料類型：
    • 抗體（如Protein A/G柱，用于抗體純化）
    • Ni²⁺或Co²⁺（金屬離子柱，用于His標簽蛋白純化）
    • GST（谷胱甘肽柱，用于GST標簽蛋白純化）
    • Lectin（用于糖蛋白純化）
• 緩沖液：
  • 平衡緩沖液（Binding Buffer）
  • 洗脫緩沖液（Elution Buffer）
  • 洗滌緩沖液（Wash Buffer）

 

設備：

• 層析系統（如FPLC, 實驗所用儀器為輝因科技的HassPure25）
• 離心機
• 超聲波破碎儀（如需裂解細胞）
• UV檢測器（檢測蛋白的洗脫峰）

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3. 實驗步驟
Step 1. 樣品制備

1. 裂解細胞或組織，提取蛋白。

• 裂解緩沖液：含有適量的蛋白酶抑制劑，防止蛋白降解。
• 超聲波、反復凍融或機械方法破碎細胞。

 

1. 離心去除細胞碎片，收集上清液（含目標蛋白）。

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Step 2. 層析柱的準備

1. 平衡親和柱：

• 用平衡緩沖液（如含20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4）多次沖洗親和柱。
• 確保柱內環境適合目標蛋白結合。

 

1. 預洗柱子（可選）：

• 使用去離子水或低濃度洗滌液去除填料中的雜質。

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Step 3. 蛋白結合

1. 將樣品緩慢加載到親和柱上（流速低于0.5 mL/min）。
2. 保證目標蛋白與填料上的配體充分結合。

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Step 4. 洗滌雜質

1. 用洗滌緩沖液沖洗柱子，去除非特異性結合的蛋白。
2. 檢測流出液中的蛋白含量（如280 nm吸光度），確保雜質被洗脫。

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Step 5. 蛋白洗脫

1. 使用洗脫緩沖液破壞目標蛋白與配體的結合：

• 常見洗脫方式：
  • 改變pH值（如加入低pH緩沖液）。
  • 添加競爭性配體（如谷胱甘肽）。
  • 使用高鹽濃度或變性劑（如尿素、鹽酸胍）。

1. 收集洗脫液中的目標蛋白（分段收集以確保分離純度）。

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Step 6. 后續處理

1. 緩沖液更換：通過透析或超濾，將蛋白換入適合后續實驗的緩沖液中。
2. 濃縮蛋白：使用超濾管濃縮蛋白。
3. 蛋白純度檢測：

• SDS-PAGE（蛋白電泳）
• Western Blot（驗證特異性）
• 活性檢測（如果蛋白有酶活性）。

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4. 注意事項

1. 樣品保護：避免目標蛋白變性，保持低溫（4°C）。
2. 避免污染：確保柱子、緩沖液和設備的清潔。
3. 填料選擇：根據蛋白的標簽或特性選擇適合的親和柱。
4. 蛋白保存：洗脫后的蛋白應迅速存儲（如-80°C），避免降解。

如果有具體的實驗條件或目標蛋白信息，可以進一步優化流程！對于實驗來說，雖然影響因素眾多，但是穩定性高，輸出一致性好的儀器也是很重要的。

實驗數據最后結果如下：