使用G418篩選HEK-293T細胞的詳細步驟

1. 細胞培養：復蘇HEK-293T細胞，用合適的培養基（如DMEM高糖培養基，含 10%胎牛血清等）在37℃、5% CO₂培養箱中培養，待細胞匯合度達80%-90% 時進行傳代或轉染操作。
2. 確定G418篩選濃度：如客戶所做，在96孔板中接種細胞，設置 0 - 1100 μg/mL的G418濃度梯度，用CCK8 檢測培養24小時的細胞活性，繪制細胞活力圖，確定HEK-293T細胞的G418 最小致死量。
3. 轉染：將目的基因連接到pCDNA3.1載體上，使用合適的轉染試劑（如Lipofectamine 3000 ），按照試劑說明書將重組載體轉染到HEK-293T細胞中，轉染6小時后換液。
4. 加藥篩選：轉染后1 - 2天，根據確定的最小致死量，加入適量G418進行篩選。可以先采用較低濃度篩選一輪，比如最小致死量的 1/2 - 2/3濃度，維持篩選2 - 3周，期間每2 - 3天換液并補充G418 。然后再用較高濃度（接近或等于最小致死量）進行第二輪篩選1 - 2周。
5. 單克隆挑選：待細胞形成單克隆后，用有限稀釋法或細胞克隆環將單克隆細胞挑選到96孔板中繼續培養，擴大培養后檢測目的基因的表達情況。

HEK-293T細胞篩選注意事項

1. 細胞狀態：確保用于轉染和篩選的HEK-293T細胞處于良好的生長狀態，細胞活力應在90% 以上，且無支原體等污染。
2. 轉染效率：優化轉染條件，包括轉染試劑與DNA的比例、轉染時間等，以提高轉染效率。可設置不同轉染條件的對照組，確定最佳轉染方案。
3. G418質量：G418的質量對篩選結果影響較大，應選擇質量可靠的產品，使用前檢查其效價和純度，溶解后過濾除菌，-20 ℃保存。
4. 篩選濃度：篩選濃度需根據細胞活力圖結果和實驗經驗確定，濃度過低可能導致假陽性細胞過多，過高則可能殺死陽性細胞。
5. 換液頻率：篩選期間換液頻率不宜過高或過低，過高可能導致細胞生長受影響，過低可能使代謝廢物積累影響細胞狀態和篩選效果。
6. 無菌操作：整個篩選過程需嚴格遵守無菌操作規范，防止雜菌污染。


文獻資料:
• 《分子克隆實驗指南（第四版）》
• 《細胞生物學實驗技術教程》
• Kaufman R J. Large-scale mammalian cell culture[J]. Current opinion in biotechnology, 1990, 1(2): 175-180.