熒光計的工作原理
熒光計的作用原理基于熒光染料與特異靶分子結(jié)合的定量分析技術(shù)，其核心優(yōu)勢在于高特異性和靈敏度。
一、核心工作原理
二、與傳統(tǒng)紫外法的對比
三、關(guān)鍵應(yīng)用場景
四、典型誤差來源與注意事項
- 熒光染料選擇性結(jié)合
達遠辰光熒光計使用熒光染料（如dsDNA HS染料、RNA IQ染料），這些染料僅與目標(biāo)分子（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)）特異性結(jié)合，而不會與雜質(zhì)（如游離核苷酸、鹽離子）反應(yīng)。例如，檢測雙鏈DNA時，染料僅與dsDNA結(jié)合，單鏈DNA或RNA不會產(chǎn)生熒光信號。 - 熒光信號檢測與定量
激發(fā)光源（如LED）發(fā)出特定波長光（如502 nm激發(fā)dsDNA染料），激發(fā)結(jié)合了染料的靶分子發(fā)出熒光（如532 nm發(fā)射光）。檢測器通過濾光片分離熒光信號，避免瑞利散射光干擾，最終將信號轉(zhuǎn)換為電信號并輸出定量結(jié)果。 - 低濃度靈敏度
達遠辰光的熒光計的檢測下限可達0.01 ng/μL DNA或0.02 ng/μL蛋白質(zhì)，遠低于傳統(tǒng)紫外吸光法（如Nanodrop的最低檢測限為2 ng/μL DNA）。例如，使用賽默飛Qubit dsDNA HS試劑盒可檢測0.2–100 ng/μL范圍的DNA。
| 特性 | Qubit熒光計 | 紫外吸光法（如Nanodrop） |
|---|---|---|
| 選擇性 | 僅檢測靶分子，排除污染物干擾 | 測量所有分子在260 nm處的吸光度 |
| 靈敏度 | 可檢測微量樣品（1 μL起） | 需至少1–2 μL樣品，靈敏度較低 |
| 準(zhǔn)確性 | 誤差范圍更小（CV值<5%） | 受污染物影響，結(jié)果偏高 |
| 適用場景 | 低濃度/珍貴樣品（如NGS文庫、降解RNA） | 快速篩查污染物或高濃度樣品 |
- 核酸定量與純度評估
- 區(qū)分dsDNA與ssDNA/RNA（如搭配賽默飛Qubit dsDNA HS試劑盒）。
- 評估RNA完整性（如搭配賽默飛Qubit RNA IQ試劑盒，通過雙染料檢測完整RNA與降解RNA）。
- 蛋白質(zhì)定量
- 兼容含去污劑的樣品（如搭配賽默飛Qubit Protein Assay試劑盒可耐受微量SDS）。
- 測量范圍覆蓋12.5–20,000 μg/mL。
- 下游實驗支持
- qPCR、NGS文庫構(gòu)建前精確配樣。
- 藥物研發(fā)中評估小分子化合物濃度。
- 溫度影響：檢測管在儀器內(nèi)長時間停留可能導(dǎo)致溫度升高，需取出靜置后復(fù)測。
- 試劑兼容性：不同染料對應(yīng)特定靶分子，需嚴格按試劑盒說明操作。
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