畢赤酵母表達人溶菌酶基因及其活性分析
摘要
利用畢赤酵母表達系統(tǒng)高效表達人溶菌酶基因，通過優(yōu)化密碼子、發(fā)酵條件及純化工藝獲得高純度重組蛋白。采用某品牌SDS-PAGE和Western blot驗證表達產(chǎn)物，并通過某品牌酶標儀測定其抗菌活性。結(jié)果表明，重組人溶菌酶具有顯著的溶菌活性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了實驗依據(jù)。
引言
溶菌酶（Lysozyme）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的天然抗菌蛋白，能夠水解細菌細胞壁中的肽聚糖，從而發(fā)揮抗菌作用。人溶菌酶因其良好的生物相容性和安全性，在醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)具有重要應(yīng)用價值。然而，天然提取的人溶菌酶產(chǎn)量低、成本高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。
畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種高效的真核表達系統(tǒng)，具有蛋白折疊正確、翻譯后修飾完善、發(fā)酵密度高等優(yōu)勢，已成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主。通過優(yōu)化人溶菌酶基因的密碼子，構(gòu)建重組表達載體，利用畢赤酵母進行高效表達，并對表達產(chǎn)物進行純化和活性分析，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)高活性人溶菌酶提供技術(shù)支撐。
實驗部分
1. 材料與方法
1.1 菌株與載體
實驗選用畢赤酵母GS115作為表達宿主，載體選用某品牌pPIC9K質(zhì)粒。人溶菌酶基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后由某試劑公司合成。
1.2 主要試劑與儀器
某品牌限制性內(nèi)切酶（EcoR I、Not I）
某品牌T4 DNA連接酶
某品牌質(zhì)粒提取試劑盒
某品牌PCR擴增試劑
某品牌蛋白電泳及Western blot試劑
某品牌酶標儀
威尼德電穿孔儀（用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化）
某品牌發(fā)酵罐（5 L規(guī)模）
2. 實驗方法
2.1 表達載體的構(gòu)建
基因合成與擴增：根據(jù)畢赤酵母偏好密碼子優(yōu)化人溶菌酶基因，并引入EcoR I和Not I酶切位點，通過PCR擴增目標片段。
酶切與連接：使用EcoR I和Not I雙酶切pPIC9K載體及PCR產(chǎn)物，純化后通過T4 DNA連接酶進行連接。
轉(zhuǎn)化與篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至某品牌大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含某品牌抗生素的LB平板，篩選陽性克隆并測序驗證。
2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選
線性化重組質(zhì)粒：使用Sal I酶切重組質(zhì)粒，使其線性化。
電穿孔轉(zhuǎn)化：采用威尼德電穿孔儀將線性化質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，參數(shù)設(shè)置為1.5 kV，25 μF，200 Ω。
高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選：將轉(zhuǎn)化子涂布于含某品牌G418的YPD平板，篩選高抗性克隆，并通過PCR驗證整合情況。
2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達
種子液培養(yǎng)：將陽性克隆接種于BMGY培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，1%甘油），30℃、250 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600≈6。
甲醇誘導(dǎo)：離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），每隔24 h補加甲醇至終濃度0.5%，持續(xù)誘導(dǎo)96 h。
發(fā)酵優(yōu)化：在5 L發(fā)酵罐中采用分批-補料策略，控制溶氧30%、pH 6.0，以提高蛋白產(chǎn)量。
2.4 蛋白純化
上清液處理：離心收集發(fā)酵液上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。
離子交換層析：使用某品牌SP Sepharose FF柱，緩沖液為20 mM磷酸鈉（pH 7.0），線性NaCl梯度洗脫。
凝膠過濾層析：進一步純化采用某品牌Superdex 75柱，緩沖液為PBS（pH 7.4）。
2.5 蛋白檢測與活性分析
SDS-PAGE與Western blot：采用某品牌12% SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物，轉(zhuǎn)膜后使用抗人溶菌酶抗體進行Western blot驗證。
酶活性測定：以Micrococcus lysodeikticus為底物，測定重組溶菌酶在450 nm處的吸光值變化，計算酶活單位。
抗菌實驗：采用瓊脂擴散法檢測重組溶菌酶對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。
結(jié)果與分析
1. 重組表達載體的構(gòu)建
經(jīng)PCR及測序驗證，優(yōu)化后的人溶菌酶基因成功插入pPIC9K載體，構(gòu)建了pPIC9K-Lysozyme重組質(zhì)粒。
2. 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與表達
高拷貝轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示約14 kDa的特異性條帶，與預(yù)期人溶菌酶大小一致。Western blot進一步證實了目標蛋白的表達。
3. 發(fā)酵優(yōu)化與純化
在5 L發(fā)酵罐中，通過控制溶氧和pH，蛋白產(chǎn)量達到1.2 g/L。經(jīng)兩步層析純化后，蛋白純度>95%。
4. 酶活性分析
重組人溶菌酶比活性為28,000 U/mg，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為15 mm和12 mm，表明其具有良好的抗菌活性。
討論
研究成功實現(xiàn)了人溶菌酶在畢赤酵母中的高效表達，并通過優(yōu)化發(fā)酵條件顯著提高了產(chǎn)量。純化后的重組蛋白具有與天然溶菌酶相當?shù)幕钚裕瑸槠涔I(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。未來可進一步優(yōu)化糖基化修飾，以提高其穩(wěn)定性和生物活性。
結(jié)論
畢赤酵母表達系統(tǒng)可高效生產(chǎn)具有生物活性的重組人溶菌酶，純化工藝簡單且產(chǎn)率高，為大規(guī)模應(yīng)用提供了可行方案。
參考文獻
1. 申艷敏;魏建超;尚書文;牛明福;周玉珍;周斌;曹瑞兵;陳溥言;侯繼波;人源抗菌肽LL-37在畢赤酵母中的高效表達及其活性檢測[J];微生物學(xué)通報;2008年04期
2. 何金花;劉譽;劉冠杰;李琳娜;李海成;王麗娟;溶菌酶在醫(yī)藥中的應(yīng)用及其研究進展[J];今日藥學(xué);2008年02期
3. 孫懷昌,張泉,施偉慶,李國才,于峰人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠體內(nèi)的表達[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2004年02期
4. 王穎,郝彥玲,羅云波人溶菌酶基因的克隆及其在真核菌株中表達質(zhì)粒pPIC9K/hLZM的構(gòu)建[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2004年04期
5. 雷連成,韓文瑜,喬紅偉大腸桿菌耐藥性中藥抑制劑的初步研究[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2003年04期
6. 于政權(quán),樊寶良,戴蘊平,鄭敏,�；哿�,王美麗,王麗麗,費菁,李寧轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達重組人溶菌酶[J];科學(xué)通報;2003年20期
7. 矯慶華,錢世鈞,葉軍,郭偉人工合成人溶菌酶基因在大腸桿菌中表達[J];生物工程學(xué)報;1997年01期
利用畢赤酵母表達系統(tǒng)高效表達人溶菌酶基因，通過優(yōu)化密碼子、發(fā)酵條件及純化工藝獲得高純度重組蛋白。采用某品牌SDS-PAGE和Western blot驗證表達產(chǎn)物，并通過某品牌酶標儀測定其抗菌活性。結(jié)果表明，重組人溶菌酶具有顯著的溶菌活性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了實驗依據(jù)。
引言
溶菌酶（Lysozyme）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的天然抗菌蛋白，能夠水解細菌細胞壁中的肽聚糖，從而發(fā)揮抗菌作用。人溶菌酶因其良好的生物相容性和安全性，在醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)具有重要應(yīng)用價值。然而，天然提取的人溶菌酶產(chǎn)量低、成本高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。
畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種高效的真核表達系統(tǒng)，具有蛋白折疊正確、翻譯后修飾完善、發(fā)酵密度高等優(yōu)勢，已成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主。通過優(yōu)化人溶菌酶基因的密碼子，構(gòu)建重組表達載體，利用畢赤酵母進行高效表達，并對表達產(chǎn)物進行純化和活性分析，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)高活性人溶菌酶提供技術(shù)支撐。
實驗部分
1. 材料與方法
1.1 菌株與載體
實驗選用畢赤酵母GS115作為表達宿主，載體選用某品牌pPIC9K質(zhì)粒。人溶菌酶基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后由某試劑公司合成。
1.2 主要試劑與儀器
某品牌限制性內(nèi)切酶（EcoR I、Not I）
某品牌T4 DNA連接酶
某品牌質(zhì)粒提取試劑盒
某品牌PCR擴增試劑
某品牌蛋白電泳及Western blot試劑
某品牌酶標儀
威尼德電穿孔儀（用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化）
某品牌發(fā)酵罐（5 L規(guī)模）
2. 實驗方法
2.1 表達載體的構(gòu)建
基因合成與擴增：根據(jù)畢赤酵母偏好密碼子優(yōu)化人溶菌酶基因，并引入EcoR I和Not I酶切位點，通過PCR擴增目標片段。
酶切與連接：使用EcoR I和Not I雙酶切pPIC9K載體及PCR產(chǎn)物，純化后通過T4 DNA連接酶進行連接。
轉(zhuǎn)化與篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至某品牌大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含某品牌抗生素的LB平板，篩選陽性克隆并測序驗證。
2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選
線性化重組質(zhì)粒：使用Sal I酶切重組質(zhì)粒，使其線性化。
電穿孔轉(zhuǎn)化：采用威尼德電穿孔儀將線性化質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，參數(shù)設(shè)置為1.5 kV，25 μF，200 Ω。
高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選：將轉(zhuǎn)化子涂布于含某品牌G418的YPD平板，篩選高抗性克隆，并通過PCR驗證整合情況。
2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達
種子液培養(yǎng)：將陽性克隆接種于BMGY培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，1%甘油），30℃、250 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600≈6。
甲醇誘導(dǎo)：離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），每隔24 h補加甲醇至終濃度0.5%，持續(xù)誘導(dǎo)96 h。
發(fā)酵優(yōu)化：在5 L發(fā)酵罐中采用分批-補料策略，控制溶氧30%、pH 6.0，以提高蛋白產(chǎn)量。
2.4 蛋白純化
上清液處理：離心收集發(fā)酵液上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。
離子交換層析：使用某品牌SP Sepharose FF柱，緩沖液為20 mM磷酸鈉（pH 7.0），線性NaCl梯度洗脫。
凝膠過濾層析：進一步純化采用某品牌Superdex 75柱，緩沖液為PBS（pH 7.4）。
2.5 蛋白檢測與活性分析
SDS-PAGE與Western blot：采用某品牌12% SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物，轉(zhuǎn)膜后使用抗人溶菌酶抗體進行Western blot驗證。
酶活性測定：以Micrococcus lysodeikticus為底物，測定重組溶菌酶在450 nm處的吸光值變化，計算酶活單位。
抗菌實驗：采用瓊脂擴散法檢測重組溶菌酶對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。
結(jié)果與分析
1. 重組表達載體的構(gòu)建
經(jīng)PCR及測序驗證，優(yōu)化后的人溶菌酶基因成功插入pPIC9K載體，構(gòu)建了pPIC9K-Lysozyme重組質(zhì)粒。
2. 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與表達
高拷貝轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示約14 kDa的特異性條帶，與預(yù)期人溶菌酶大小一致。Western blot進一步證實了目標蛋白的表達。
3. 發(fā)酵優(yōu)化與純化
在5 L發(fā)酵罐中，通過控制溶氧和pH，蛋白產(chǎn)量達到1.2 g/L。經(jīng)兩步層析純化后，蛋白純度>95%。
4. 酶活性分析
重組人溶菌酶比活性為28,000 U/mg，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為15 mm和12 mm，表明其具有良好的抗菌活性。
討論
研究成功實現(xiàn)了人溶菌酶在畢赤酵母中的高效表達，并通過優(yōu)化發(fā)酵條件顯著提高了產(chǎn)量。純化后的重組蛋白具有與天然溶菌酶相當?shù)幕钚裕瑸槠涔I(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。未來可進一步優(yōu)化糖基化修飾，以提高其穩(wěn)定性和生物活性。
結(jié)論
畢赤酵母表達系統(tǒng)可高效生產(chǎn)具有生物活性的重組人溶菌酶，純化工藝簡單且產(chǎn)率高，為大規(guī)模應(yīng)用提供了可行方案。
參考文獻
1. 申艷敏;魏建超;尚書文;牛明福;周玉珍;周斌;曹瑞兵;陳溥言;侯繼波;人源抗菌肽LL-37在畢赤酵母中的高效表達及其活性檢測[J];微生物學(xué)通報;2008年04期
2. 何金花;劉譽;劉冠杰;李琳娜;李海成;王麗娟;溶菌酶在醫(yī)藥中的應(yīng)用及其研究進展[J];今日藥學(xué);2008年02期
3. 孫懷昌,張泉,施偉慶,李國才,于峰人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠體內(nèi)的表達[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2004年02期
4. 王穎,郝彥玲,羅云波人溶菌酶基因的克隆及其在真核菌株中表達質(zhì)粒pPIC9K/hLZM的構(gòu)建[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2004年04期
5. 雷連成,韓文瑜,喬紅偉大腸桿菌耐藥性中藥抑制劑的初步研究[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2003年04期
6. 于政權(quán),樊寶良,戴蘊平,鄭敏,�；哿�,王美麗,王麗麗,費菁,李寧轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達重組人溶菌酶[J];科學(xué)通報;2003年20期
7. 矯慶華,錢世鈞,葉軍,郭偉人工合成人溶菌酶基因在大腸桿菌中表達[J];生物工程學(xué)報;1997年01期
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