隨著國家藥品監(jiān)督管理局批準了一批 AAV 制劑的臨床試驗申請，越來越多的 AAV 制劑進入大眾視野。AAV 制劑中病毒滴度的準確定量，是影響療效的關鍵因素。因此建立準確、穩(wěn)定的檢測流程對于細胞和基因治療企業(yè)來說尤為重要。數字 PCR 作為新一代的核酸定量工具，以其絕對定量與精準性高等特點，被細胞和基因治療行業(yè)快速接納并應用。
  腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一類單鏈線狀 DNA 缺陷型病毒，需要輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制。在基因治療的研究中，通常使用不需輔助病毒的重組 AAV 病毒（rAAV）將目的基因序列插入 rAAV 表達質粒中，包裝病毒，然后直接使用 rAAV 感染細胞就能完成目的基因的插入操作。rAAV 作為基因療法載體有以下優(yōu)勢：安全性高、免疫原性低；宿主細胞范圍廣；擴散能力強；體內表達基因時間長；適用種類多樣等。
 
腺相關病毒 AAV 的檢測
AAV 制劑的滴度檢測是生物企業(yè)中重要的環(huán)節(jié)，穩(wěn)定及精確的檢測結果是臨床給藥的基礎保障。根據現有的檢測手段及原理，可以將其分為物理滴度及感染滴度兩大類型。物理滴度主要是指病毒顆粒滴度及基因組滴度，感染滴度主要指目的基因的轉導滴度。
 
物理滴度目前的主流方法是熒光定量法（qPCR），但 qPCR 往往由于其本身的技術原因，不同批次試劑中不同的標準曲線會影響其對最終濃度的計算，導致最終的滴度計算有所偏差。
 
達普生物提供一種更精準的檢測方案 —— 微滴式數字 PCR，可以直接量化 DNA 拷貝數。這種方法具有以下特點：
 
1. 絕對定量：無需標準曲線，直接定量目的序列，減少實驗復孔及標準曲線帶來的額外操作和實驗誤差。
2. 更加準確：與 qPCR 相比，數字 PCR 可以消除不同 PCR 反應擴增效率的不同引入的定量偏差。
3. 更加精確：實驗重復性好，實際樣品測試結果 CV＜15%；且不受人為因素影響，在不同實驗人員操作的情況下，結果均顯示較小差異。
 

	qPCR	數字 PCR
定量能力	依賴標準曲線，相對定量	絕對定量
精準度	好	極佳
重復性	好	極佳
抑制劑耐受情況	一般	較好
數據分析	人工劃定閾值	儀器自動分析

 
正是由于以上優(yōu)點，美國藥典章節(jié) “US Pharmacopeia Standards for Cell and Gene Therapy” 中，對 AAV 制劑的滴度測定推薦了數字 PCR 方法用于替代 qPCR 方法。  
達普生物 AAV 病毒核酸滴度檢測套裝
為推動 AAV 病毒滴度更加精準定量，助力 AAV 制劑療法的深入研究。近日，達普生物基于星云數字 PCR 平臺，自主設計開發(fā)了 “腺相關病毒（AAV）滴度檢測試劑盒（數字PCR法）”。達普生物的星云數字 PCR 平臺搭配本試劑盒，為客戶提供從病毒制品準備到結果導出的完整解決方案，可應用于 AAV 生產制造中的質量控制。
   
達普生物-腺相關病毒（AAV）滴度檢測試劑盒優(yōu)勢：

• 操作簡便：無需標準曲線，試劑盒利用率高。
• 兼容性好：適合多種血清型檢測。
• 準確性好：具有較好的靈敏度、特異性，不受部分序列二級結構影響。
• 性價比高：數字 PCR 方法與 qPCR 方法實際耗材成本相似。
• 優(yōu)化流程：部分制品可使用免提取策略直接檢測培養(yǎng)物中的病毒滴度。

 
數字 PCR 定量檢測無需標準曲線
● 低濃度重復性較好
 
qPCR 定量檢測需要標準曲線
● 多批次，樣品少的檢測環(huán)境需要重復多次標準曲線
● 標準品需要稀釋，操作要求較高，重復性（尤其是低濃度）欠佳
 
達普生物數字 PCR 系統(tǒng)軟件合規(guī)性 
為滿足企業(yè)客戶需求，達普生物數字 PCR 分析軟件 - Astrolabe 合規(guī)版軟件系統(tǒng)功能符合 FDA 21 CFR Part 11 法規(guī)，經檢測保留的數據可作為檢驗后追溯的有效數據來源，確保生物醫(yī)藥企業(yè)生產、質控中數據記錄的合規(guī)性。
 
參考文獻：
1. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery；Nat Rev Drug Discov. 2019 May ; 18(5): 358–378. doi:10.1038/s41573-019-0012-9.
2. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR；Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr 1; 25(2): 115–125.Published online 2013 Dec 12. doi: 10.1089/hgtb.2013.131
3. https://en.wikipedia.org/wiki/
 
  達普生物科技有限公司孵化于香港科技大學，于 2018 年由多位海歸博士共同創(chuàng)立。在深圳、嘉興、香港三地設有研發(fā)中心，研發(fā)團隊近百人，建立了集微流控芯片、儀器及試劑生產為一體的 GMP 廠房。
 
公司專注于將液滴微流控技術應用于精準醫(yī)學領域，致力于成為集微流控芯片、儀器、試劑的研發(fā)和生產于一體的完整解決方案提供商。公司自主研發(fā)、生產三大技術平臺：高通量篩選系統(tǒng)、數字 PCR 系統(tǒng)和單細胞組學系統(tǒng)，應用于高通量藥物質檢、抗體篩選、生物制品質檢、癌癥研究、癌癥早期篩查、靶向治療、無創(chuàng)產前診斷和病毒定量檢測等領域。
 
更多產品 ●彗星高通量篩選系統(tǒng)
1. 基于熒光標記及電介泳效應推動分選，無損傷；
2. 接駁星海單細胞建庫系統(tǒng)，提高建庫質量并降低測序成本；
3. 接駁星云數字 PCR 系統(tǒng)，篩選陽性液滴，富集微量靶標 ，降低測序成本；
4. 快速單克隆抗體細胞株或轉染陽性單細胞篩選。
  ●星云全自動數字PCR系統(tǒng)
1. 專利壓力不敏感液滴生成技術：液滴生成大小均一，擴增更穩(wěn)定；
2. 3.5 分鐘內可同時處理 1-32 個樣本：上樣靈活，滿足高通量需求；
3. 液滴可回收，接駁彗星高通量篩選系統(tǒng)，后續(xù)用于測序或目標基因檢測。
  ●星海單細胞建庫系統(tǒng)
1. 采用獨家開發(fā)的水凝膠編碼微球和液滴微流控技術，性能優(yōu)越；
2. 針對不同細胞數、種類及上樣量，1-4 通道，靈活調整，使用更加方便；
3. 流程靈活，可以接駁下游流程。
 
 達普生物ThunderBio
達普生物科技有限公司致力于成為集微流控芯片、儀器、試劑、耗材研發(fā)生產一體的完整解決方案提供商。自主研發(fā)生產的兩大技術平臺：數字PCR和單細胞組學系統(tǒng)。產品適用于癌癥早期篩查、靶向治療、無創(chuàng)產前診斷、病毒定量檢測、高通量藥物和抗體篩選等領域。