簡介
焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。佰臻生物擁有QIAGEN公司最新的PyroMark Q24焦磷酸測序儀（圖2-37），采用成熟的焦磷酸測序技術，是集測序、樣品制備、試劑和對照以及完整和靈活的軟件于一體的系統。PyroMark Q24非常適用于二、三和四等位基因突變以及連續CpG位點分析及定量，相比于Sanger測序需在測序前進行耗時的PCR產物克隆，獨特的PyroMark Q24在數分鐘內即可提供1-24個樣品的序列分析及高度準確的定量結果。
技術特點：
(1) 流水線式流程：多功能PyroMark Q24可與表觀遺傳學和基因分析流程無縫結合，且與QIAGEN先進的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉化和PCR擴增技術相兼容；流水線式的流程意味著可更快速地獲得結果。
(2) 快速簡便：從PCR產物到單鏈樣品直接用于測序，應用PyroMark Q24真空底座可在15分鐘內同時制備24個樣品，使用該工作站操作簡單，且手動時間少于5分鐘。
(3) 自動化分析：PyroMark Q24軟件包含兩種分析模式：CpG和 AQ（等位基因定量分析）。這兩種模式可在同一個板上分析，支持同時分析不同類型的樣品。AQ模式可用于分析單個和多元位點以及二、三和四等位基因突變；CpG模式可用于分析多重連續CpG位點，提供亞硫酸氫鹽處理的內參。
樣品要求：
1) 樣品純度：OD 260/280值應不小于1.6；260/230值不小于1.6；全基因組DNA無降解
2) 樣品濃度：最低濃度不低于25ng/µl；
3) 樣品總量：每個片段總量不少于500ng；
4) 樣品溶劑：溶于純水或TE中；
5) 樣品運輸：低溫運輸（-20℃）；且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現污染。
實驗內容：
基因組DNA首先經過亞硫酸氫鹽處理，序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶保持不變。亞硫酸氫鹽轉化完成后，根據研究目的的不同可以選擇不同的DNA 甲基化檢測方法，明確是研究整體水平的甲基化還是特定位點的甲基化，或是要發現全基因組中新的甲基化位點，根據客觀條件篩選最靈敏、可靠、經濟、簡便的方法進行分析。
Pyrosequencing技術（圖2-38）通過檢測CpG對應位點上C/T滲入的比例對目標位點的甲基化程度進行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。該技術通過將鏈合成過程中釋放出的焦磷酸（PPi（轉化成光信號來監測鏈的合成過程。測序引物可與PCR擴增的單鏈DNA模板雜交，與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶等酶以及底物，包括腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和熒光素一起孵育。與模板鏈互補的dNTP在DNA聚合酶的催化下結合到DNA鏈上，每次互補結合都會釋放與dNTP摩爾量相當的焦磷酸（PPi）。存在APS的條件下ATP硫酸化酶將PPi轉化為ATP，ATP可驅動熒光素酶介導的熒光素氧化，發出與ATP量成正比的可見光。熒光素酶催化反應產生的可見光可用電荷耦合器檢測，可在原始數據輸出中看到一個峰值（Pyrogram）。每個峰的高度（光信號）與結合的核苷酸量成正比。三磷酸腺苷雙磷酸酶是一種核苷酸降解酶，可連續降解未結合的核苷酸與ATP。降解完成之后，結合另一個核苷酸。dNTP是依次添加的，反應時Alfa-硫代三磷酸脫氧腺苷（dATPS）是dATP的替代物，因為DNA聚合酶對dATPS的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATPS不是熒光素酶的底物。當反應繼續時，形成互補的DNA鏈，核苷酸序列由Pyrogram的信號峰值確定。
