——即蛋白質N端氨基酸序列分析技術服務

“Edman降解，蛋白質化學的經典方法，氨基酸序列分析的金標準之一。”

Edman降解法是異硫氰酸苯酯（PITC）在弱堿（TMA）條件下與蛋白質N端α-氨基偶聯生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-蛋白質），然后在無水強酸（TFA）條件下，N端的第一個殘基從完整的多肽、蛋白鏈上以2-苯氨基噻唑啉酮（ATZ-AA）的形式裂解下來，之后在稀酸（25% TFA）條件下，ATZ-AA轉化為更加穩定的苯基乙內酰硫脲衍生物，即PTH-氨基酸，生成的PTH-AA輸送至高效液相色譜中進行在線分析，剩下的多肽蛋白樣品可反復進行上述處理，依次生成各種PTH-AA，經液相系統色譜柱分離可以確定被測多肽蛋白質供試品N端的氨基酸排列順序。

技術流程

技術特點

•  
•   可靠性最高的測序方法

■  對蛋白質多肽樣品的純度要求很高

■  非標準氨基酸無法測定

分析應用

“Edman降解法N端測序在未知蛋白的測序方面發揮不可替代的作用。”

蛋白質的生物合成均起始于N端，其N端序列的組成對生物學功能有著巨大的影響，例如蛋白質的半衰期、蛋白質在亞細胞器中的定位等等。并且N端可發生多種翻譯后修飾，這些也與蛋白質的功能和穩定性息息相關。因此，對于蛋白質N端序列的分析，有利于幫助分析蛋白質的高級結構，揭示蛋白質的生物學功能。并且隨著現代醫藥工業的發展，出現了大量的蛋白質和多肽類藥物分子，對這些蛋白質多肽類藥物分子N端序列的分析確認也是醫藥工業質量控制的重要環節。

技術指標

■  樣品要求：

     純度不低于95%；蛋白質樣品N端未封閉；提供樣品的相對分子質量；樣品含量不低于10 μg。

■  儀器設備：

           全自動蛋白儀·多肽N端測序儀（SHIMADZU型號：PPSQ-33A）

■  分析軟件：

           PPSQ-30-Analysis、PPSQ-30-Data processing

           色譜柱（WAKO型號：Wakosil-PTH （4.6 mm*250 mm））

■  實驗原理：

Edman降解法原理圖

案例分析

      案例一：抗體類蛋白質的輕重鏈分析和N端氨基酸序列測定

樣品名稱：XXXXXXX理化測定對照品

批號：XXX-XXX-XXXX-X

樣品狀態：PVDF膜（抗體）

樣品重鏈理論序列為：NH2-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X

譜圖結果：

案例二：未知序列蛋白質類樣品的N端氨基酸序列分析

樣品名稱：未知

樣品狀態：PVDF膜

樣品理論序列：未知

譜圖結果：

Q&A

1)    N端測序儀的介紹。

多肽蛋白質N端測序儀生產制造商主要有美國ABI公司和日本SHIMADZU公司。兩家公司的儀器均是基于Edman降解原理進行N端測序，只是在后續的PTH-AA色譜分離條件方面存在差異。隨著后來ABI公司逐漸退出N端測序儀市場，相應的儀器也已停產，使得SHIMADZU公司現在成為N端測序儀方面的主要制造商，其主要的N端測序儀型號為：PPSQ-33A、PPSQ-31A。

2)    Edman方法和質譜方法的比較介紹。

Edman降解法和質譜分析方法作為現有主要的蛋白質樣品N端分析方法，有其各自的優缺點。Edman降解法作為現有蛋白質樣品N端序列測試的黃金標準，已得到廣泛應用，但還是存在不足之處，其通量較低，每個殘基測試需花費45分鐘時間，且每個殘基測試的費用成本較高，對于N端封閉的蛋白質樣品無法直接進行N端測序。

質譜法分析作為蛋白質樣品N端分析的另外一種手段，其通量高，成本相對較低，對N端封閉樣品可以進行測試，但其對于未知序列的蛋白質難以做出正確判斷，且無法區分分子量相近的氨基酸（I/L、Q/K），所以兩種方法蛋白質樣品N端測序過程中可以相互進行補充。

3)    N端氨基酸測序的樣品準備過程。

PVDF膜蛋白質樣品可直接進行N端測序。N端測序對樣品純度要求較為嚴格，如果樣品純度低于95%需進行電泳分離純化，之后電轉印至PVDF膜上進行N端測試。如果樣品純度高于95%，可進行簡單處理后進行N端測試，處理過程為：液體樣品可直接通過prosorb轉移至PVDF膜上，固體樣品用0.1% TFA溶液溶解后用相同方法亦轉移至PVDF膜上，之后切取樣品膜進行測試，如為小肽樣品或測試循環數較多（>20）需進行樣品固定處理。