外周血由于采集難度小，一直是疾病標志物研究和臨床診斷應用的主要載體。外周血蛋白標志物的檢測更是能夠監控疾病的動態變化，成為主要的標志物類型。尤其是對于非腫瘤疾病，在沒有CTC細胞和ctDNA作為協同標志物的前提下，外周血中蛋白標志物的篩選與檢測就顯得尤為重要。

      然而，外周血中的蛋白質高度復雜，動態范圍達11-12個數量級，既有以白蛋白（Albumin）為代表的mg級的高豐度蛋白質（占據外周血總蛋白質量的99%），又有以細胞因子為代表的fg級蛋白質。因此，對于外周血蛋白標志物的篩選和研究也充滿著挑戰。

 

 

 

 

 

     一般情況下，對于復雜的蛋白質的篩選來說，液相色譜-質譜串聯（LC-MS/MS）技術成為首選。然而，常規LC-MS/MS技術基于bottom-up的篩選策略（將所有蛋白質無差別的酶解成多肽后，同步進入質譜進行檢測），在大量高豐度蛋白存在的情況下，LC-MS/MS往往會更傾向于檢出高豐度蛋白質，對于ng級以下的低豐度蛋白質（尤其是IL-1β、IL-6、INF-γ等重要細胞因子）的檢測能力嚴重不足。

      同時，外周血中的蛋白質來源豐富，既有細胞凋亡脫落的表面蛋白，也有細胞主動分泌的細胞因子，還有多種細胞分泌的外泌體所攜帶的蛋白質等。經過大量實驗數據累積，我們發現在外周血蛋白質組研究如果僅用傳統的LC-MS/MS實驗方案進行篩選，數據始終是片面的。同樣的血漿樣品，用LC-MS/MS和Antibody Array技術所篩選到的蛋白種類和功能類別交叉性很少，而外泌體攜帶的蛋白質既與血漿total蛋白組檢出數據有一定的交集。同時，對于特定類型的蛋白質，外泌體也具有顯著的富集效果（如下圖）：

|   華盈生物外周血蛋白質組學分析

      為獲得高質量的外周血蛋白質組數據，華盈生物在檢測方法上進行了創新升級，以盡可能觀測到外周血蛋白質組的全譜，形成了獨特的外泌體蛋白組“1+1+1”體系。

●   首先，利用FAIMS和TIMS為代表的4D質譜預處理裝置，對進入MS前的離子進行預篩選，簡稱“離子過濾”。通過電場和氮氣源的綜合作用，將特定離子尤其是1價雜離子進行有效去除，提高進入質譜儀的離子純度，進而在傳統LC-MS/MS鑒定深度的基礎上再提高10%-20%的鑒定蛋白譜。

●   進一步，華盈生物利用特色的抗體芯片技術對于LC-MS/MS所不能識別的分泌蛋白類型進行補充鑒定，一次性可特異性的檢測500+種蛋白質，極大地豐富了外周血低豐度蛋白譜。

●   同時，華盈生物利用在外泌體定量蛋白質組學上的優勢，在獲得高純度外泌體的基礎上，利用LC-MS/MS技術進行深度的外泌體蛋白質組解析，將對于外周血中的蛋白譜，尤其是外泌體攜帶的母本細胞的膜蛋白譜進行更加全面的覆蓋。

|   經典案例

      國家蛋白質組中心研究團隊發現銀屑病治療中成藥“銀屑靈”在臨床上對不同患者療效存在差異性，為在治療前幫助臨床醫生找到“銀屑靈”的適應患者，研究人員利用深度蛋白質組學技術（LC-MS/MS 結合 Antibody Array）的策略開展用藥伴隨標志物研究。

      研究結果顯示：利用LC-MS/MS的DIA技術篩選到的蛋白質與Antibody Array篩選到的蛋白質的種類具有明顯的分界線，即LC-MS/MS篩選到的蛋白譜主要集中在血清中ng級以上的蛋白質群體，而Antibody Array篩選到的蛋白譜主要集中在ng-pg級的蛋白質群體中。同時，兩種技術均發現了一些“銀屑靈”差異響應（Responder  vs  Non-responder）蛋白質，組合兩種技術篩選到的蛋白標志物可以更為有效地對“銀屑靈”差異響應患者進行區分。

|   相關文獻

[1]. Xihao Du, Qingli Zhang, Yixuan Jiang，et al. Dynamic molecular choreography induced by traffic exposure: A randomized, crossover trial using multi-omics profiling. J Hazard Mater. 2022 Feb 15;424(Pt A):127359.

[2]. Meng Xu, Jingwen Deng, Kaikun Xu, et al. In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine. Theranostics, 2019, 9(9):2475-2488.