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本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 NE 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 NE與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠NE，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，NE濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中NE濃度。

1.          收集標(biāo)本：血清、血漿（肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。血清、血漿作1：10稀釋（取20ul，加標(biāo)本稀釋液180ul,稀釋10倍）。細(xì)胞培養(yǎng)上清可以不做稀釋直接檢測。

2.          標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入6ml蒸餾水混勻，配成200ng/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第一管加標(biāo)本稀釋液900ul，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在第一管中加入200ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.          10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

1.          加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.          洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。

3.          每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8.          每孔加入100ul終止液混勻。

9.          30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

1.          所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。

2.          以標(biāo)準(zhǔn)品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0 ng/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.          根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)NE含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

             1.   靈敏度：最小的NE 檢測濃度小于0.15ng/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠NE。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3.        重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10％。

             1.   以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！