關于ELISA樣本值低于空白值的問題
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在ELISA實驗中，樣本值低于空白值是一個經(jīng)常性的問題。當樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發(fā)生樣本值低于空白值的現(xiàn)象，特別是在血清和血漿樣本的檢測。究其原因，主要在于兩個方面，一方面是誤差，另一方面是基質(zhì)效應。下文逐個分析不同影響因素的原理、和解決方案。 一、誤差 Error 誤差分為三類，系統(tǒng)誤差、隨機誤差和過失誤差。這三類誤差中，系統(tǒng)誤差對樣本值和空白值之間的差異無影響。ELISA樣本值低于空白值在誤差方面主要來源于隨機誤差和過失誤差。 |
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| 1、 隨機誤差 Random Error 無法控制的變因，使測量值產(chǎn)生隨機分布的誤差，服從統(tǒng)計學上的正態(tài)分布。從統(tǒng)計學上來看，測量值有99%的置信限在±3SD之間，如果CV值是20%，隨機誤差的邊界就是±60%，也就是說在CV值20%的狀況下，樣本值低于空白值60%之內(nèi)，有可能是隨機誤差的影響，特別是空白值只有一個值時。 隨機誤差不可消除，只能通過多次測量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機誤差的解決方案1是增加空白值的重復數(shù)量，一般認為空白值重復10次，測量均值接近真值。 方案2是提高實驗技能，也能夠有效降低隨機誤差的影響。如果CV值在5%，樣本值趨近于零時，在統(tǒng)計上樣本值將不會低于空白值15%。 2、 過失誤差 Gross Error 過失誤差主要是由于測量者的疏忽，犯了不應有的錯誤造成的。過失誤差是可以避免的。針對于ELISA樣本值低于空白值的問題，過失誤差產(chǎn)生的原因多數(shù)來源于空白孔HRP的重復加樣或污染或洗滌不干凈，造成空白值偏高，相對比來說，樣本值低于空白值。解決方案就是重復實驗，規(guī)范操作。 | |
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二、基質(zhì)效應 Matrix Effect 分析中，基質(zhì)指的是樣本中被分析物之外的組分，基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應。ELISA試劑盒在開發(fā)過程中，標準品不能采用人或動物血清、血漿作為標準曲線的稀釋液，只能采用其模擬物。模擬物與被測樣本在蛋白豐度、復雜性、pH等因素都會存在差異。當樣本的基質(zhì)與其模擬物相比，降低抗原抗體的結(jié)合，便產(chǎn)生了樣本值低于空白值的現(xiàn)象。造成樣本值無法計算出數(shù)值，或者數(shù)值為負。 目前最常用的去除基質(zhì)效應的方法是，通過已知分析物濃度的標準樣品，同時盡可能保持樣本中的基質(zhì)不變，建立一個校正曲線（Calibration Curve）。 當單個樣本或少量樣本值低于空白值時，可能是誤差原因，這時應增加重復，提高操作技能。當大量樣本都低于空白值時，應考慮基質(zhì)效應的影響，建立校正曲線予以修正。 | |
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