銳賽小課堂1221-157

熒光原位雜交技術（ fluorescence in situ Hybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法，用特殊的熒光素標記核酸探針，在細胞或組織切片標本上進行雜交，以檢測細胞內 DNA 或 RNA 特定序列存在與否。

FISH 實驗操作與用非熒光標記探針的原位雜交基本相似。在組織準備方面，新鮮組織、冷凍組織樣本、細胞涂片、培養細胞爬片等材料均可以用于進行FISH 實驗檢測。

以下談談用細胞爬片進行 RNA FISH 檢測的一些總結。

一、實驗流程

1. 細胞在蓋玻片上進行培養，細胞長好后用 CSK 緩沖液簡單洗滌。

2. 細胞爬片用 4% 多聚甲醛在 4℃ 固定 10 min。

3. 用含有 0.5% TritonX-100,，10 mM VRC 的 CSKBuffer 溶液在 4℃ 處理 10-12 min。

4. 用 70% 酒精，4℃，孵育 10 min。

5. 在-20℃, 分別用 70%，85% 和 100% 的酒精處理 5 min，進行脫水，最后風干。

然后用中性樹膠將細胞爬片粘在載玻片上 （正面朝上）。

6. 探針的準備，將加了探針的雜交緩沖液置于 76℃ 變性處理 10 min。

7. 將 5ul 雜交混合液滴在爬片上，蓋上蓋玻片，經 Rubber Cement 橡膠封片，置于潮濕暗盒中 37 ℃ 雜交過夜。

8. 雜交后，去除橡膠和蓋玻片，爬片用 50% 甲酰胺 (2XSSC 配) 在 42℃，洗 5 minX3，然后用 2XSSC 在42℃，洗 5 minX3。

9.DAPI 復染，取適量 DAPI 儲存液用 PBS 稀釋至 1ug/ml 的工作液，吸 5μL 滴爬片上，蓋上蓋玻片，黑暗室溫孵育 5min。去掉蓋玻片，在 PBS 中洗滌 2 次。去掉過量液體，滴加 antifade reagent 封片。

10. 熒光顯微鏡下觀察

二、注意事項

1、做 RNA FISH 實驗，首先要防止 RNA酶的污染。操作過程中應自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并經常更換。所有實驗用到玻璃制品都要高溫滅菌，且各種溶液要用 DEPC 水配制。

2、去污劑 triton X-100 處理的目的是增加細胞的通透性，利于雜交探針進入細胞，其處理時間因應不同的細胞而有所不同。注意：過度的去污劑處可能會引起靶核酸的丟失。

3、熒光見光就會淬滅，因此操作過程要做好避光。

4、將細胞爬片粘在載玻片上，確保有細胞的那面朝上。

5、實驗所用探針是雙鏈 DNA 探針，而雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。因此在做 RNA FISH 雜交前，探針必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。

6、探針的濃度因其種類和實驗要求而有所不同，一般為 0.5-5ng/ul。合適的探針濃度要通過實驗才能確定。

7、雜交反應時，蓋玻片不可有氣泡，不然妨礙探針與細胞的接觸。

8、玻片經 antifade reagent 封片后可在 4℃ 暗處保存 2-3 星期而不失去全部熒光，但 FISH 操作完成后要及時觀察采圖。

9、如果鏡檢時，觀察到有非特異結合造成的高背景。可能原因有：不合適的探針量，不適合的雜交后洗滌，又或者是樣本中有過多的重復序列。解決方法：1）使用合適的探針量；2）改善雜交后的洗滌，如洗滌液要新鮮配制，增加洗滌液的量，延長洗滌時間等；3）使用 DNA 阻斷劑，在探針中加入一定量的 DNA 競爭性阻斷劑如 COT-1 DNA 或鮭精 DNA 來競爭性結合基因組中重復性片段。
 

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