一、操作安全性

 （1）可在生物安全柜、常規超凈工作臺（不開啟排風機）中進行慢病毒使用操作；

 （2）操作者須穿著實驗服，戴口罩、一次性手套，謹防毒液直接接觸眼耳鼻口或皮膚傷口；

 （3）操作過程注意避免毒液飛散、滴灑，注意勿被銳利器材、針頭等劃破皮膚；

 （4）不慎直接接觸毒液的操作臺、需回收器材，可通過0.25% SDS、70%乙醇、1%次氯酸鈉等溶液滅活病毒；

 （5）使用過的工作臺面、顯微鏡載物臺等經70%乙醇擦拭；

 （6）培養器皿、槍頭等廢棄物應84消毒液(1:9稀釋)浸泡，或121℃高溫消毒，方可丟棄。

二、慢病毒的保存

（1）慢病毒載體經過干冰運輸，在-80℃可保存6個月，保存超過6個月時需重新摸索工作滴度。

（2）凍存的毒液在使用前置于冰上或4℃融化，最好于當天用完，未用完的毒液可暫時保存于4℃，不超過2天。

（3）反復凍融會嚴重降低慢病毒滴度，每次凍融可降低20%以上，建議在初次使用時按用量進一步小量分裝凍存。

慢病毒包裝

三、慢病毒包裝常見問題及預防

1、不宜使用polybrene的常見細胞系

Polybrene可以通過中和細胞表面糖蛋白唾液酸殘基所帶電荷起到增加慢病毒感染效率的作用。但對一些細胞具有明顯細胞毒性，若使用反而影響實驗效果。這些細胞有例如：HSC-T6（大鼠肝星型細胞），Raw264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），MCF-7（人乳腺癌細胞），H929（人多發性骨髓瘤細胞），GBC-SD（人膽囊癌細胞株），NB4（人白血病細胞株），kasumi（人白血病細胞株），Jurkat（人白血病細胞株），等。建議在開始實驗前查閱相應文獻報道，以及參考的polybrene工作濃度。

2、過表達不成功的可能原因

（1）質粒構建有一定的問題。

（2）由于序列具有特殊結構導致轉錄困難、mRNA十分不穩定等情況下，可導致mRNA水平無法顯著過表達。在排除質粒構建問題之后，先通過q-PCR驗證目的基因在mRNA水平的過表達，可以同時使用293T等易表達細胞作為對照。

（3）如果mRNA水平能夠過表達，可能由于存在翻譯后修飾、密碼子構成、翻譯效率、蛋白快速降解等因素，導致蛋白水平過表達不顯著。同時，使用WB進行蛋白水平分析時，需要設置陽性對照，對實驗條件，尤其是抗體進行驗證。

3、如何提高病毒感染效率

 除了提高MOI以外，還可以從其他角度嘗試改善感染效率。

（1）適當減小孵育培養基體積（加入病毒量不變），可增大病毒密度，有利于提高感染效率。減小體積孵育時需考慮對細胞狀態、換液時間的影響。例如，96孔板（50ul），24孔板（250ul），6孔板（1ml），小體積孵育4h，然后補液至正常培養體積，繼續培養24h后換液。

（2）適當延長孵育時間。如延至24 h再換液，注意需要兼顧細胞狀態，主要適用于原孵育時間較短（如4-6 h）時。因為慢病毒在37℃半衰期約8小時，所以一味延長孵育時間效用并不明顯。

（3）Polybrene對于很多細胞可提高感染效率，但同時也存在細胞毒性，對部分類別細胞（如神經元、DC細胞）毒性較大而不宜使用。當MOI低于20時，也沒有添加Polybrene的必要。具體細胞的Polybrene使用濃度可參考文獻報道，以及通過預實驗確定。通常在4-10 ug/ml范圍。Protamine sulfate作為Polybrene替代物對部分細胞毒性較小。

（4）如果有可離心孔板的平角離心轉頭，可以2200rpm邊離心邊感染2 h（37℃），然后繼續置于培養箱中按標準條件孵育培養。該方式對于懸浮細胞的感染尤為有益。

（5）如果細胞狀態允許，可進行重復感染。孵育結束后更換不含病毒的完全培養基，培養16-24 h后，重復感染過程1-2次，可提高感染效率。

四、 “病毒包裝+蛋白質組”專屬方案

方案一：根據興趣因子尋找下游作用因子

病毒轉染到細胞后，將要研究的基因過表達或者敲低，通過SILAC和iTRAQ技術，我們可以找到相關通路差異表達蛋白，再進行相關通路特定蛋白的驗證，輕松幫您找到您研究的因子的相關通路關鍵效應因子。

方案二：根據特定條件尋找特定作用因子

通過SILAC和iTRAQ技術，我們可以篩選特定條件（藥物、刺激因子等）下細胞（標本）蛋白水平的變化，根據研究課題的方向，找到相關的通路的差異蛋白。再進行特異基因在細胞水平或者在體水平的干擾或者過表達，進行細胞功能或者在體驗證。