全組織細胞色素氧化酶活性染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

全組織細胞色素氧化酶活性染色試劑是一種旨在使用細胞色素C催化人工電子供體染料二氨基聯苯胺的非酶源性自然氧化，形成棕褐色不溶性產物，來分析全組織樣品中細胞色素氧化酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心改良傳統NADI方法、成功實驗證明的。主要適用于各種動物組織的細胞色素氧化酶活性的定性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。 

技術背景

細胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸鏈的酶部分的總稱。其存在于真核生物的細胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）是人工電子供體染料，通過與金屬蛋白，例如含鐵蛋白細胞色素C中的物理性結合，產生非酶源性自然氧化，同時提供電子（細胞色素C作為電子受體）于呼吸鏈的電子傳遞系統，由此呈現出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產物，且不受乙醇影響。在DAB自然氧化的同時，產生活性氧，例如過氧化氫，由過氧化氫酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通過細胞色素氧化酶的作用，亞鐵細胞色素C被氧化成正鐵細胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性產物被用于檢測組織細胞中細胞色素氧化酶的活性。 

產品內容

清理液（Reagent A）  200毫升

染色液A（Reagent B1）   40毫升

染色液B（Reagent B2）    4瓶

反應液（Reagent C）    3毫升

固著液（Reagent D）   30毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和反應液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養箱：用于反應孵育

中性樹脂：用于切片封片

光學顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實驗步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取9毫升染色液A（Reagent B1）到1瓶染色液B（Reagent B2）里，混勻，標記為染色工作液，置于冰槽里備用，避免光照（注意：有效期1周）；繼續移取2.7毫升染色工作液到新的1.5毫升離心管，加入300微升反應液（Reagent C），混勻后，標記為反應工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。

• 準備1個6孔細胞培養板
• 放進新鮮切除的動物組織樣本（注意：建議組織大小為0.5厘米厚，1厘米長；如果過大，最好刀切處理一下）
• 將組織壓平
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升反應工作液，浸沒整個組織
• 放進37℃培養箱，孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去反應工作液
• 小心加上3毫升清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 小心抽去清理液
• 重復實驗步驟9至10二次
• 小心加入3毫升固定液（Reagent D），浸沒整個組織
• 在室溫下孵育15分鐘
• 小心抽去固定液
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 在室溫下孵育15分鐘
• 小心抽去清理液
• 重復實驗步驟15至17二次
• 后續石蠟切片（6微米厚）或冰凍切片（10微米厚）
• 在光學顯微鏡下觀察和計數：表達細胞色素氧化酶活性的組織細胞為陽性組織細胞，呈現棕色。

注意事項

• 本產品為10次操作
• 操作時，須戴手套
• 染色液（Reagent B）和反應液（Reagent C）避免反復凍融
• 染色工作液不宜久存，1周內使用為佳
• 陰性對照時，GENMEN反應工作液可含有疊氮化鈉
• 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 整個操作，在避光狀態下進行
• 染色孵育時間，根據樣品和酶活性強弱調整，通常為1至3小時
• 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 
• 樣品染色后保存，避免光照
• 細胞色素氧化酶活性染色參考圖像： 

本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰